Nat Commun｜天津医科大学杨吉龙团队应用单细胞转录组分析揭示肢端型黑色素瘤肿瘤细胞异质性和免疫环境特征
撰文︱杨吉龙，张 超
责编︱王思珍，方以一
编辑︱杨彬薇肢端型黑色素瘤（acral melanoma，AM）在全球范围内是一种发病率较低的黑色素瘤亚型，发生于四肢远端掌侧及甲床。该亚型约占欧美黑色素瘤患者的5%，却占据东亚人群黑色素瘤患者的约50%[1]，其发病率也呈逐年上升趋势，预后较差，严重威胁着人们的健康。不同于皮肤型黑色素瘤，肢端型患者的基因组以结构重排和扩增为特征，且缺乏BRAF和RAS基因突变[2]。随着免疫治疗时代的到来，抗PD-1治疗在皮肤型黑色素瘤的患者中展现出明显的疗效[3]，而对于肢端型患者其客观有效率（ORR）仅为16.6%，姑息治疗和辅助治疗的总体疗效都不甚理想[4]。这也意味着肢端型黑色素瘤的晚期治疗及术后辅助治疗，缺乏有效且具有针对性的靶向药物及免疫治疗方法。因此，通过更为精准的单细胞测序方法，从肿瘤异质性和免疫环境等方面进一步探索肢端型黑色素瘤的内在特征，从而寻求更为有效的临床治疗方案，迫在眉睫。
2022年11月25日，天津医科大学肿瘤医院杨吉龙教授、李祥春教授、陈可欣教授课题组合作在 Nature Communications上发表了题为 “A single-cell analysis reveals tumor heterogeneity and immune environment of acral melanoma”的研究。该研究首次应用中国肢端型黑色素瘤患者单细胞测序数据，对该亚型黑色素瘤的细胞组成、肿瘤细胞异质性及免疫微环境特征进行了全面的展示。研究者揭示了肢端型黑色素瘤的肿瘤细胞功能亚群、免疫抑制状态以及潜在的联合免疫治疗策略。
本研究应用自主研发的单细胞表达特征自监督深度学习方法Miscell[5]，对在Discovery set中5例肢端型和3例皮肤型黑色素瘤（图1A）单细胞测序数据进行了聚类和细胞亚群定义。发现肢端黑色素瘤（AM）和皮肤黑色素瘤（CM）的病变中均有7种基本细胞类型组成，包括黑色素瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、NK细胞、单核巨噬细胞及B细胞（图1B-C），且免疫浸润中以T细胞为主（图1D）。
图1 肢端型和皮肤型黑色素瘤的单细胞图谱
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
为了探讨黑色素瘤肿瘤细胞的异质性。研究者对黑色素瘤的肿瘤细胞进行了单独的聚类分析，根据功能将肿瘤细胞注释为5个功能亚组（图2A-B），并将其定义为5个Signature，分别为Signature1 （胆固醇代谢功能），Signature2（富集Wnt信号通路），Signature3（细胞周期相关），Signature4（TGF-beta信号通路），Signature5（I型干扰素信号通路）（图2C）。接下来，研究者利用伪时间分析工具Monocle[6]，探究5种功能亚群的发育关系。发现Signature2（富集Wnt信号通路）和Signature3（细胞周期相关）位于发育树的早期，提示更为原始；而Signature1 （胆固醇代谢功能），Signature4（TGF-beta信号通路），Signature5（I型干扰素信号通路）位于发育树的中末段提示该部分肿瘤细胞分化较为成熟（图2D-E）。研究者观察到样本肿瘤细胞的Signature组成存在明显差异，可以被分为两类，一类C1以Signature2，3为优势，另一类C2以Signature1，4，5为主导。C1和C2患者的总生存存在差异趋势（图2F-G）。
图2 黑色素瘤细胞的五个功能亚组
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
为了进一步揭示和验证这一发现，研究者对内部TMCH-57和TCGA-SKCM两个RNA测序队列以及TMCH-602临床数据队列进行了分析。结果显示肿瘤细胞以Signature1，4，5为主导的黑色素瘤患者的总体生存明显优于Signature2，3为主导的患者（图3A-E）。此外，该研究还发现肢端型黑色素瘤（AM）中，更多的患者肿瘤细胞主要以Signature1，4，5功能为优势（图3F-H），这也可能是真实世界中肢端型患者总体生存优于皮肤型患者的原因之一（图3I-J）。
图3 黑色素瘤肿瘤细胞异质性与总生存的关系
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
肢端型黑色素瘤较差的免疫治疗疗效，可能与其特殊的免疫环境浸润和T细胞活性存在密切的关系。研究者为了揭示AM的免疫环境特征，对免疫细胞进行了进一步分析。该研究定义了黑色素瘤中6种基本的免疫细胞类型（图4A-B），并且根据特征性的表达差异将T细胞定义为14种类型（图4C）。通过对比AM和CM14种亚型T细胞的浸润差异，研究者发现AM富含更多的Treg细胞的浸润，并且应用免疫荧光染色进行了验证（4D-F）。Treg细胞被普遍认为是一种在肿瘤环境中起免疫抑制作用的细胞类型，富含Treg细胞可能是AM患者免疫治疗疗效不佳的原因之一。
图4 肢端型黑色素瘤的免疫浸润特征
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
CD8+T 细胞是作用肿瘤免疫杀伤的重要T细胞类型。研究者对两种亚型的CD8+ T细胞的发育激活状态进行了深入探讨。对比CM，AM患者的CD8+ T细胞主要处于初始化（Naive）和耗竭型（Exhausted）状态，缺乏细胞毒性（Cytotoxicity）（图5A-E）。并且研究者发现，肢端型黑色素瘤（AM）处于耗竭型状态的CD8+ T细胞，以同时高表达TIM-3和PD-1为特征（图5G）。此发现在组织水平的多色荧光免疫染色试验中得到了验证（图6A-E）。这一发现提示联合应用抗PD-1和抗TIM-3药物，可能会是肢端型患者获益。
图5 黑色素瘤CD8+ T细胞发育激活状态分析
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
图6 多色免疫荧光染色验证CD8+ T细胞状态
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
研究者通过细胞水平的药物实验，来进一步证实联合应用抗PD-1和抗TIM-3药物对两种黑色素瘤亚型的肿瘤细胞凋亡的影响（图7A）。结果证实，联合抗PD-1和抗TIM-3药物，无法提高皮肤型黑色素瘤患者的肿瘤细胞凋亡比例（图7C）；却可以明显提高肢端型患者肿瘤细胞的凋亡比例，两种药物疗效呈现叠加甚至协同作用（图7B）。这一细胞水平的实验验证，初步证实了联合抗PD-1和抗TIM-3药物可能使肢端型患者受益的猜想。但该方案仍需更大规模的动物模型实验及进一步临床试验的考验。
图7 细胞水平药物实验验证抗PD-1+抗TIM-3药物提高肢端型黑色素瘤细胞凋亡
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
大多数肢端型患者对单药抗PD-1治疗产生抵抗，本研究中利用一个患者抗PD-1治疗前后的肿瘤单细胞测序数据揭示了该AM患者免疫治疗耐药之后的免疫环境变化。研究者发现免疫治疗耐药后的肢端型样本（Acral3-post）的免疫细胞浸润比例发生了显著变化，其中CD8 +T细胞比例明显减少，而CD4+ T和B细胞的比例明显上升（图8A，F-G）。并且接受抗PD-1治疗之后该患者CD8+ T细胞失去了原有的与NF-kB、抗原提呈、趋化因子通路等相关的免疫活性功能（图8B-C）。并且细胞毒性状态的CD8+T细胞比例降低，GNLY、GZMB、PRF等细胞毒性相关基因的表达明显降低（图8D-E）。但研究者仅揭示出抗PD-1治疗耐药的前后的免疫环境的特殊变化，但其因果关系以及内在机制尚不明确，希望能为该领域进一步的深入研究提供有价值的信息。
图7 抗PD-1耐药的肢端型患者治疗前后免疫环境差异
（图源：Chao Zhang, et al., Nat Commun, 2022）
综上所述，本研究基于肢端型黑色素瘤单细胞测序转录组测序，首次定义了肢端型黑色素瘤的肿瘤环境7种基本细胞类型，揭示了代表黑色素瘤肿瘤细胞异质性的五种功能亚群，并发现其与总生存密切相关。肢端型黑色素瘤免疫细胞浸润以Treg细胞为主，且CD8 +T细胞大多处于高表达TIM-3和PD-1的耗竭状态，缺乏细胞毒性。该研究还通过细胞水平药物实验，进一步证实联合抗PD-1和抗TIM-3药物明显提高了肢端黑色素瘤细胞的凋亡比例。总之，作为国内首个肢端型黑色素瘤单细胞图谱，该研究对肢端型黑色素瘤进行了全面且深入的探讨。研究结果为该领域的研究者提供了一个宝贵的资源，有助于加深对肢端黑色素瘤相关机制的理解，为肢端型患者的开发更有效的治疗靶点和免疫治疗相关生物标志物提供了有价值的信息。该项研究仍有需要进一步的工作，如测序样本均来自中国患者，且样本量有限。虽然研究中的关键发现已经在欧美人群黑色素瘤外部数据集[7-9]中得到了部分验证，然而在不同种族和族裔之间的肿瘤异质性和免疫微环境的相似性和差异方面，仍需进一步探究等。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-34877-3
通讯作者：杨吉龙（第一排左三）；第一作者：张超（第三排右四）
（照片提供自：杨吉龙教授团队）
通讯作者：李祥春（第一排右三）；第一作者：张超（第二排右一），沈鸿儒（第一排右一）
（照片提供自：李祥春教授团队）
通讯作者：陈可欣（第一排左二）
（照片提供自：陈可欣教授团队）
杨吉龙教授, 男，主任医师，博士生导师，天津医科大学肿瘤医院/天津市肿瘤医院骨与软组织肿瘤科行政副主任，临床PI。兼任中国抗癌协会黑色素瘤专委会候任主委、天津市抗癌协会黑色素瘤专委会主委、中国抗癌协会青年理事会常务理事、中国抗癌协会肉瘤专委会常委等。曾获天津市131创新型人才、全国卫生系统青年岗位能手等称号。主要从事骨肿瘤、软组织肉瘤、恶性黑色素瘤以手术治疗为主的综合治疗，精通骨与软组织肿瘤、骶前肿瘤、腹膜后肿瘤、四肢骨盆及脊柱转移癌的手术治疗及综合治疗。科研工作专注于肉瘤、恶性黑色素瘤的基因组组学、转化医学及精准治疗。发表SCI论文80余篇，累计影响因子超过400，他引次数超过2000次，单篇他引次数270次。SCI文章H指数25，i10指数36。主持或参与国家级及省部级以上课题13项，主编或参编专著12部，获省部级以上科技奖励5项。培养30余名博士及硕士研究生，多人次获国家奖学金、优秀研究生、优秀毕业研究生等荣誉。
李祥春教授为天津医科大学肿瘤医院、天津市肿瘤研究所教授、博士研究生导师、PI，生物信息平台负责人、国家级青年拔尖人才、天津市“131”创新型人才培养工程第一层次人选。主要从事生物信息学、肿瘤基因组学和人工智能的研究工作，具有深厚的科研创新能力，在癌症诊疗与转化应用研究领域取得了一定的学术成就。近五年来，累计在国际权威期刊如Nature, Lancet Oncology, JAMA Oncology, Annals of Oncology等国内外一流杂志上发表SCI论文20余篇，以通讯作者和第一（共同）作者发表13篇，2017年总因子为270.766，5年影响因子为270.983；多次在国内国际相关肿瘤大会上发言报告；主持两项国家自然科学基金。兼任Cancer Biology & Medicine，Oncogene，Frontiers in Oncology，Briefings in Bioinformatics等期刊审稿人。
陈可欣教授，现任天津医科大学肿瘤医院副院长，天津医科大学科技处处长，中国抗癌协会肿瘤流行病专业委员会主任委员、中国抗癌协会癌症筛查与早诊早治专委会副主任委员、教育部“创新团队发展计划”带头人、天津市预防医学会流行病学分会主任委员、天津市肿瘤分子流行病重点实验室主任。主持科技部国家重点研发计划、教育部创新团队发展计划及滚动支持项目、863专项、科技部新药创制平台项目、国家自然科学基金等项目。以通讯作者在Lancet Oncology，JAMA Oncology，Nature Communications，Ann Oncol等著名期刊上发表学术论文70余篇。作为第一完成人获得天津市科技进步一等奖、中国抗癌协会一等奖和教育部二等奖各1项。
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2. Yeh, I., et al. Targeted Genomic Profiling of Acral Melanoma. Journal of the National Cancer Institute 111, 1068-1077 (2019).
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本文完