Exp Mol Med︱刘金保/陈鑫团队发现去泛素化酶STAMBP促三阴性乳腺癌进展新功能

撰文︱杨倩倩，陈  鑫

责编︱方以一，王思珍

编辑︱杨彬薇

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤，也是导致全世界女性癌症相关死亡的主要原因之一。乳腺癌是一种高度异质性的疾病，根据其遗传和组织病理学特征可分为5个亚型[1]，包括基底样/三阴性乳腺癌(TNBC)、管腔A型、管腔B型、人表皮生长因子受体2 (HER2)过表达型和正常乳腺样型。TNBC的特征是肿瘤不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)或HER2基因，约占所有乳腺癌病例的15%[2]。作为一种侵袭性和转移性亚型，TNBC缺乏公认的分子靶点，常常对化疗产生耐药性[3]。因此，探索治疗TNBC的治疗新靶点仍是一个亟待解决的问题。

泛素-蛋白酶体系统是所有真核生物细胞内蛋白质质量控制的主要途径，它参与许多生物过程的调节，影响底物蛋白的稳定、功能和亚细胞定位[4, 5]。在正常情况下，泛素化是一个可逆的过程，由去泛素化酶（deubiquitinating enzyme）介导。然而在包括肿瘤在内的一些病理条件下，活性异常的去泛素化酶影响靶蛋白的稳定性和功能[6]。信号转导接头分子(STAM)结合蛋白（STAM-binding protein，STAMBP)，是一种 Zn+依赖的JAMM类去泛素化酶，作为内体相关去泛素化酶，可以与内体分选运输复合体(ESCRT) 的组件蛋白STAM互相作用。研究表明，STAMBP的突变与小头-毛细血管畸形综合征相关[7]，并可能与肺腺癌和黑色素瘤的肿瘤转移有关[8, 9]，但STAMBP在TNBC中的作用尚未阐明。

2022年11月25日，广州医科大学刘金保教授和陈鑫副研究员课题组在Experimental & Molecular Medicine上发表了题为“The deubiquitinating enzyme STAMBP is a newly discovered driver of triple-negative breast cancer progression that maintains RAI14 protein stability”的研究。该研究基于siRNA文库筛选发现STAMBP可促进TNBC的体内外恶性进展。进一步免疫沉淀-质谱和功能实验发现STAMBP与肌动蛋白结合蛋白RAI14结合并抑制其k48位泛素化降解，从而稳定RAI14蛋白水平，促进TNBC上皮间质转化(EMT)。该研究可能为认识去泛素化酶在TNBC中的作用提供一个新的理论依据，并为TNBC治疗提供潜在的分子靶点。（拓展阅读：陈鑫&刘金保课题组相关研究进展，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：Nat Commun︱广州医科大学陈鑫等发现EIF4E促铁死亡新功能）

为了鉴定与TNBC生长有关的去泛素化酶，作者使用去泛素化酶siRNA文库（包含96种去泛素化酶siRNA）转染BT549细胞，72h细胞活力检测发现，STAMBP对BT549细胞的增殖能力影响最大（图1a-b）。进一步探究发现，敲低STAMBP可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549的细胞增殖、迁移和侵袭能力（图1c-e），而过表达STAMBP的结果与之相反。以上结果证明STAMBP可以促进TNBC的细胞增殖、迁移和侵袭能力。

图1 STAMBP促进TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭

（图源：Q. Yang, et al., EXP MOL MED, 2022）

鉴于STAMBP是一个去泛素化酶，作者使用免疫沉淀-质谱的方法分析了STAMBP的底物蛋白，质谱结果中四个排行靠前的蛋白分别为RBM14、RAI14、LIMA1和PABPC1（图2a-b）。但进一步的干扰实验证明，在两个乳腺癌细胞中，敲低STAMBP只能下调RAI14的表达，并不影响RBM14和PABPC1的水平；同时，LIMA1的水平只在BT549细胞中受影响（图2c）。作者进一步使用免疫沉淀和免疫荧光实验证实了STAMBP和RAI14在两个细胞中的结合和共同定位（图2d），明确了STAMBP与RAI14在细胞中的相互作用。

图2 STAMBP与RAI14互相作用

（图源：Q. Yang, et al., EXP MOL MED, 2022）

作者推测STAMBP可能调控RAI14的稳定性。因此，作者检测了STAMBP对RAI14基因水平和蛋白水平的影响，发现在两个乳腺癌细胞中，STAMBP不影响RAI14的mRNA水平（图3a），而是影响其蛋白水平及半衰期（图3b）。考虑到蛋白质降解一般通过UPS或自噬两大途径进行，作者验证了RAI14的降解途径，发现蛋白酶体抑制剂MG132而非自噬抑制剂Baf A1可以促进RAI14在细胞内的累积（图3c）。重要的是，MG132可以增加RAI14的泛素化水平（图3d），并可逆转STAMBP敲低导致的RAI14下调（图3e）。以上结果证明STAMBP可通过去除RAI14的泛素化稳定其表达。进一步的免疫沉淀实验表明，敲低STAMBP增加了RAI14的总泛素化和k48位泛素化水平（图3f）；反之，过表达STAMBP上调RAI14蛋白水平（图3g），并降低其泛素化水平（图3h）。同时，过表达STAMBP可以逆转敲低STAMBP导致的RAI14泛素化水平变化（图3i）。作者后续实验证明，过表达RAI14可以逆转敲低STAMBP导致的细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制，证明RAI14是STAMBP维持TNBC表型的关键下游分子。这些结果证明STAMBP通过抑制RAI14的泛素化稳定RAI14的表达。

图3 STAMBP通过抑制RAI14泛素化稳定其表达

（图源：Q. Yang, et al., EXP MOL MED, 2022）

作者进一步通过RNA seq实验及GO富集分析探究了RAI14的分子功能，结果表明，敲低RAI14影响下游大量分子的表达及众多细胞功能（图4a-b），尤其是细胞粘附分子结合活性功能（图4c），这与细胞迁移密切相关。由于细胞粘附分子的变化在肿瘤的上皮间质转化（EMT）中起重要作用，作者猜测RAI14可能调控TNBC的EMT进程，进一步实验发现，敲低RAI14增加上皮标记分子E-cad、降低间叶标记分子Slug、vimentin、MMP9的表达（图4d）；同时，敲低STAMBP可以逆转过表达RAI14造成的EMT相关分子变化。以上结果证明RAI14是STAMBP介导TNBC生长的关键分子。

图4 RAI14促进TNBC的增殖、迁移和侵袭

（图源：Q. Yang, et al., EXP MOL MED, 2022）

作者进一步探究了STAMBP-RAI14轴对裸鼠在体移植瘤生长的影响。与细胞实验中的发现一致，相比对照组，敲低STAMBP抑制皮下移植瘤的生长，但过表达RAI14可以逆转其效应（图5a-c）。作者进一步检测了肿瘤中ki67的表达，进一步支持了在体内STAMBP通过维持RAI14水平从而促进TNBC生长的假设（图5d）。作者还评估了STAMBP表达与TNBC患者生存预后的关系证明，STAMBP的上调与TNBC的临床进展相关。

图5 STAMBP-RAI14轴促进TNBC的体内生长

（图源：Q. Yang, et al., EXP MOL MED, 2022）

图6 STAMBP通过调节RAI14的泛素化促进TNBC进展

（图源：Q. Yang, et al., EXP MOL MED, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究揭示了STAMBP在TNBC进展中的新作用：STAMBP通过抑制RAI14的泛素化稳定其蛋白水平，从而促进TNBC的生长（图 6）。去泛素化酶是肿瘤治疗的重要靶点，作者首次证明了STAMBP在TNBC中的重要促癌作用。RNA测序及GO富集分析证明了RAI14与细胞粘附功能的关系，这为转移性乳腺癌的治疗提供了理论支持。尽管作者证明STAMBP-RAI14通路调节TNBC的生长，但现有的STAMBP抑制剂BC-1471对MDA-MB-231的细胞生长没有明显影响，因此，开发特异性的STAMBP抑制剂至关重要。总之，去泛素化酶STAMBP对TNBC进展的调节机制可能为转移性乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌的治疗打开新的视野。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s12276-022-00890-1

通讯作者：刘金保（左），陈鑫（右）

（照片提供自：刘金保/陈鑫团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

刘金保，博士，广州医科大学教授。中国病理学会蛋白质修饰与疾病专委会主任委员，广东省蛋白质修饰与降解重点实验室主任。长期从事蛋白质修饰、降解与疾病的研究。获得教育部自然科学二等奖，广东省优秀教学成果二等奖，广州市科技进步一等奖和中华医学会科技三等奖各1项，发表SCI论文大于100篇。

陈鑫，肿瘤学博士，广州医科大学副研究员，广东省蛋白质修饰与降解重点实验室科研骨干。主要研究方向是细胞死亡的新型调控机制及相关药物的研发。近三年以第一/通讯作者身份在Nature Communications、Nature Reviews Clinical Oncology、Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology、Autophagy、Cell Death & Differentiation、Journal of Experimental Medicine等期刊发表多篇SCI论文。

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参考文献（上下滑动阅读）

1. Perou, C. M. et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 406, 747–752 (2000).

2. Cao, L. & Niu, Y. Triple negative breast cancer: special histological types and emerging therapeutic methods. Cancer Biol. Med. 17, 293–306 (2020).

3. Bai, X., Ni, J., Beretov, J., Graham, P. & Li, Y. Triple-negative breast cancer therapeutic resistance: where is the Achilles’ heel? Cancer Lett. 497, 100–111 (2021).

4. French, M. E., Koehler, C. F. & Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discov. 7, 6 (2021).

5. Wang, Y. S., Wu, K. P., Jiang, H. K., Kurkute, P. & Chen, R. H. Branched Ubiquitination: detection methods, biological functions and chemical synthesis. Molecules 25, 5200 (2020).

6. Antao, A. M., Tyagi, A., Kim, K. S. & Ramakrishna, S. Advances in deubiquitinating enzyme inhibition and applications in cancer therapeutics. Cancers (Basel) 12, 1579 (2020)

7. McDonell, L. M. et al. Mutations in STAMBP, encoding a deubiquitinating enzyme, cause microcephaly-capillary malformation syndrome. Nat. Genet. 45, 556–562 (2013).

8. Xu, H. et al. STAMBP promotes lung adenocarcinoma metastasis by regulating the EGFR/MAPK signaling pathway. Neoplasia 23, 607–623 (2021).

9. Iwakami, Y., Yokoyama, S., Watanabe, K. & Hayakawa, Y. STAM-binding protein regulates melanoma metastasis through SLUG stabilization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 507, 484–488 (2018)

本文完