Nat Commun︱曹蔚/李小强团队在内毒素血症发病机制与药物治疗方面取得新突破

撰文︱唐  娜，曹  蔚

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

内毒素血症（endotoxemia，ETM）是宿主对感染的失调反应导致的器官功能障碍，病情凶险，是现代临床重症医学面临的棘手问题；其病情迁延可引起多器官功能障碍综合征，病死率高达20～30%，更是医院ICU患者死亡的首要原因[1,2]。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌释放的内毒素，作为一种极强的炎症反应刺激物，在ETM的发生发展过程中起着关键作用[3]。虽然抗生素是ETM目前治疗的基础，但迄今尚无ETM有效治疗措施[4]。

ETM心功能障碍被认为是ETM最严重的综合征之一，以心肌收缩功能受损和顺应性降低为特征，伴随着过度的心脏炎症[5]。早期阶段，LPS诱发细胞内质网Ca²⁺泄漏，导致平均动脉血压和心率急剧增加[6]；同时，LPS可直接激活心肌细胞和巨噬细胞表面的TLR4，导致促炎细胞因子过度爆发（细胞因子风暴）。晚期阶段，过度的炎症反应会导致心肌细胞收缩力下降和致命的心律失常，从而加重心功能障碍[7]。经典瞬时受体电位通道（classical transient receptor potential，TRPC）是非选择性Ca²⁺可通透性阳离子通道，在病理条件下重要地参与调控心脏收缩和炎症通路发展[8,9]。因此，探究TRPC在ETM心功能障碍发生发展中的调控机制，寻找新的治疗靶点具有重要的科学价值和临床意义。

2022年12月2日，西北农林科技大学曹蔚课题组与空军军医大学李小强课题组合作在Nature Communications上发表了题为“TRPC channels blockade abolishes endotoxemic cardiac dysfunction by hampering intracellular inflammation and Ca²⁺ leakage”的研究论文。该研究揭示了TRPC1和TRPC6显著调控内毒素所致心脏炎症级联反应和内质网Ca²⁺泄漏，从而在ETM发生发展中产生关键的作用。这一研究结果为深入揭示内毒素相关心肌病的发病机制奠定了理论基础，也为药物治疗提供了新思路。

首先，作者通过LPS诱导的ETM模型对小鼠心肌组织中TRPC家族蛋白表达进行了系统比较（图1a），针对ETM心功能障碍中蛋白表达变化最显著的TRPC1和TRPC6亚型，应用全身性Trpc1敲除和Trpc6敲除小鼠构建LPS诱导的ETM模型，结果显示Trpc1或Trpc6的敲除显著提高了ETM小鼠的生存率，心功能相关的平均动脉血压、心率和射血分数骤降均得到极大缓解，炎性浸润和心肌损伤被显著抑制（图1b-f）。IP3Rs和RYRs是细胞内质网释钙的主要受体[10]。在明确了TRPC1/6在ETM心脏高表达于心肌和巨噬细胞后（图1g），进一步采用原代分离的成年和乳鼠心肌细胞、骨髓来源和心脏来源巨噬细胞（图2c），通过基因沉默、抑制剂阻断和细胞Ca²⁺浓度干预等方法，阐明了IP3R1是LPS诱发心肌和巨噬细胞内质网释钙的主要受体亚型，TRPC1/6重要性地参与该过程（图2a-f）；但与Trpc1或Trpc6的敲除效果不同，IP3Rs的阻断并无明显ETM心功能障碍保护作用（图2g,h）。这些数据在明确了Trpc1或Trpc6的敲除极大地缓解ETM心功能障碍、提高生存率的同时，强烈提示TRPC1/6在调控该过程中依赖非内质网Ca²⁺释放的关键新机制。

图1 Trpc1或Trpc6敲除显著改善ETM心功能障碍

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

图2 抑制IP3Rs阻断了LPS诱发的胞内Ca²⁺释放但不能改善ETM小鼠心功能障碍

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

为了进一步探究关键机制，作者对Trpc1敲除和Trpc6敲除心脏RNA-seq数据进行了GO、KEGG和聚类分析，定位先天免疫反应中TLR信号通路为潜在调节通路（图3a-c）；并通过Q-PCR、ELISA和蛋白免疫印迹（WB）等实验发现Trpc1或Trpc6敲除通过调节TLR4关键衔接蛋白MyD88和TRIF等的表达，抑制下游NF-κB、MAPK和IRF3信号通路的活化，显著影响多种促炎因子的释放（图3d-g）。这些结果证实TRPCs调控ETM小鼠TLR4信号通路介导的炎症反应。

图3 Trpc1或Trpc6敲除抑制TLR4信号通路

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

由于TRPCs与TLR4无直接结合，进一步地，作者分析了RNA-seq数据中钙相关蛋白的表达，Q-PCR、WB实验发现TRPCs的分子伴侣—钙调蛋白（CaM）在Trpc1或Trpc6敲除的ETM小鼠心肌中表达显著升高，下游钙调磷酸酶（CaM结合蛋白）的激活和转录因子NFAT3核易位被抑制（图4a-e）。免疫共沉淀（Co-IP）实验证实了CaM与TRPC1或TRPC6在ETM病理条件下结合增加（图4f），提示CaM是TRPC调控ETM心功能障碍的关键蛋白。Co-IP、WB和微量热泳动（MST）实验进一步明确了Trpc1或Trpc6敲除后CaM可与TLR4蛋白直接结合，进而同时阻断MyD88和TRIF依赖性信号通路（图4g,h）；免疫荧光实验也在Trpc1或Trpc6敲除的成年小鼠心肌细胞中，直接观察到了这种特殊的TLR4与CaM在肌原纤维上的共定位现象（图4i）。以上结果证实Trpc1或Trpc6敲除可通过解除其与CaM的偶联，阻断TLR4受体激活，从而对MyD88和TRIF依赖性炎症通路产生抑制作用。

图4 Trpc1或Trpc6敲除的心肌中CaM与TLR4直接相互作用

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

为了明确TLR4与CaM的结合位点，在HEK-293T细胞中转染了影响TLR4激活的TIR结构关键氨基酸位点突变质粒，Co-IP和免疫荧光实验证明了TLR4的Poc位点（V693）可与CaM互作（图5a,b）；同时，通过合成CaM核心结合域肽链，应用非变性凝胶电泳和MST实验还发现了CaM与TLR4的TIR结构域的非典型异亮氨酸-谷氨酰胺样（IQ）基序表现出非Ca²⁺依赖的高亲和力（图5c-e）。另一方面，应用CaM不同结构域抑制剂，通过对TLR4的结合和下游信号通路的测定（图6），明确了TLR4结合在CaM的疏水口袋中。在此基础上，分子对接展现了CaM与TLR4蛋白的结合位点（图5f）。以上结果确定了CaM的疏水口袋可以通过与TLR4蛋白TIR结构域中IQ基序以及Poc位点同时相互作用，阻断TLR4活化。

图5 CaM与TLR4的Poc位点、非典型IQ基序结合

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

图6  CaM与TLR4相互作用抑制炎症级联反应

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

鉴于CaM阻断TLR4是在Trpc敲除的情况下产生的，明确TRPC的调控位点对后续药物设计倍显重要。TRPC的胞内C端包括CaM/IP3R结合（CIRB）结构域[11]。作者采用Duolink PLA、Co-IP实验发现，ETM小鼠心肌中TRPC1和TRPC6与IP3R1结合增多，而Trpc1或Trpc6的敲除显著增加CaM与IP3R1胞内相互作用（图7a-d）；免疫荧光实验观察到，LPS刺激乳鼠心肌细胞后的4 h内，定位在内质网的IP3R1，逐渐从核附近向TRPC1与CaM附近移动直到共定位。功能方面，在乳鼠心肌细胞和骨髓来源巨噬细胞中，CaM抑制剂不能改变LPS刺激引起的Ca²⁺浓度升高（图7e），但是能明显翻转Trpc1或Trpc6敲除所阻断的内质网Ca²⁺泄漏，提示Trpc敲除后解耦联的CaM可以抑制IP3R释Ca²⁺（图7f）。因此，TRPC的胞内C端CIRB结构域是TRPC调控CaM进而影响TLR4炎症信号通路和与IP3R1互作介导内质网释放Ca²⁺的关键结构域。

图7 TRPCs调节LPS诱导的细胞CaM和IP3R1的多效性作用

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

最后，作者通过虚拟筛选、MST亲和力测定从现有TRPC抑制剂库中获得与TRPC1的C末端具有亲和力的小分子化合物SKF96365（SKF）（图8a-b）。在细胞层面发现，SKF对LPS产生的炎性因子和胞内Ca²⁺浓度升高具有浓度依赖的抑制作用（图8c-d）；Co-IP结果显示，SKF可以阻断LPS刺激后TRPC1和CaM、IP3R1的相互作用，同时增加CaM与TLR4、IP3R1的结合（图8e）。在小鼠体内证实，SKF给药后可显著抑制LPS诱导的ETM模型和盲肠穿刺腹腔感染模型动物心脏射血分数降低，血清促炎因子释放以及心肌损伤，同时显著延长生存时间（图9）。这些结果表明，TRPC的C末端抑制剂可以通过调节炎症级联反应和细胞内质网Ca²⁺释放，有效地改善ETM心功能障碍。

图8 SKF通过阻断TRPC C末端结构域显著抑制LPS诱导的胞内Ca²⁺释放和TLR4介导的炎症反应

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

图9 SKF给药显著改善ETM心功能障碍

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

图10 TRPCs调控ETM心功能障碍分子机制模式图

（图源：Na Tang, et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究系统分析并阐明了TRPCs直接参与并促进ETM心功能障碍的发生发展，敲除Trpc主要亚型1和6可显著改善LPS引起的心功能障碍并延长生存时间。研究首次发现了Trpc1或Trpc6敲除改善心功能障碍的机制与抑制IP3R1介导心肌细胞、巨噬细胞的内质网Ca²⁺释放和阻断心脏炎症级联有关；研究还通过多种方法从动物、细胞和蛋白结构多层面明确了敲除Trpc1或Trpc6的ETM抗炎作用依赖于解偶联的CaM与TLR4蛋白TIR结构域的Poc位点以及非典型IQ基序结合，阻断TLR4受体激活，进而对MyD88和TRIF依赖性炎症通路均产生抑制作用。值得一提的是，TRPCs抑制剂SKF可通过阻断TRPCs与CaM/IP3R的结合域，在LPS诱导的ETM模型和小鼠盲肠穿刺腹腔感染模型中均显示出强大的心脏保护作用，并显著降低死亡率。综上，作者系统性阐述了TRPCs所致ETM心功能障碍的关键病理发生机制，证实了TRPCs是ETM治疗的潜在新靶点，并为ETM治疗提供了一种潜在的高效、特异性新方法。然而，败血症是感染不同类型病原微生物造成的多器官衰竭，TRPCs是否也通过相似分子机制调控其他类型病原菌所致器官功能障碍的病理过程尚有待进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35242-0

通讯作者：曹蔚（第二排左四），李小强（第二排左三）；第一作者：唐娜（第二排左一），田雯（第二排左二），马广源（第二排右二）

（照片提供自：曹蔚团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

曹蔚，女，西北农林科技大学教授，博士研究生导师，药学系主任、药学硕士一级学科和药学硕士专业学位两个学科点负责人。兼任陕西省学科评议组/研究生教育指导委员会委员，陕西省药理学会、生理学会、天然药物学会常务理事等。曾获陕西省青年科技新星、入选第四军医大学“精英人才库”等。主要从事分子药理学研究与新药研发工作，在多糖体内靶点及调控相关疾病发生发展的基础和应用研究方面特色突出。发表科研论文162篇，其中第一或通讯作者在Nat Commun, Carbohyd Polym, Basic Res Cardiol和Pharmacol Res等SCI收录期刊发表40篇；主持国家自然科学基金、国家科技重大专项等多项课题；获陕西省科学技术奖一等奖3项、二等奖1项；授权中国、美国发明专利13件；主编、副主编专著8部。（电子邮箱：[e-mail]）

李小强，男，空军军医大学药学系教授，博士研究生导师，空军高层次科技人才。现任国家中药胃肠药理重点研究室常务副主任，陕西省创新药物研究中心主任，陕西省秦药研发重点实验室主任，陕西省中医药中青年科研创新团队负责人，陕西省中药胃肠疾病创新药物研发共享平台负责人；兼任陕西省药理学会副理事长兼秘书长，陕西省高校教指委委员，陕西省药理学会第四届心血管药理学专委会主任委员，陕西省生物医药产业链专家。研究方向：心血管药理学与中药药理学。主持国家、军队和省级课题20余项（国家自然科学基金6项）；以通讯/第一作者等在Nat Commun, Basic Res Cardiol, Pharmacol Res, Free Radical Biology and Medicine, Oncogenesis等SCI收录期刊发表60余篇；授权国家发明专利5件；主编、副主编和参编国家规划教材等各类书籍40部；获陕西省科学技术一等奖等军队和省级成果奖6项。（电子邮箱：[e-mail]）

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完