Adv Sci︱孙凌云/余佳团队发现有独特异质性的人脐带间充质干细胞BAMBIhighMFGE8high亚群

撰文︱刘珊珊，陈洪伟责编︱方以一，王思珍编辑︱杨彬薇

间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）是一类自我更新的前体细胞，能够分化成为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞以及其它细胞类型[1]。MSC可从多种组织器官中获得，如骨髓、脐带以及脂肪组织等[2]。由于MCS具有广泛的分化潜能（可修复损伤的组织）和有效的免疫调节活性，可应用于临床治疗多种疾病，包括自身免疫性疾病、退行性疾病、癌症以及COVID-19流行性疾病。临床试验表明MSC疗法可以重置自身免疫性疾病中的免疫耐受状态。单中心和多中心临床研究已发现，静脉输注MSC对治疗药物难治性系统性红斑狼疮（SLE）患者安全有效，可长期改善难治性SLE患者的尿蛋白水平，使患者5年生存率达90%以上[3-6]。尽管MSC在临床前动物模型测试中表现出较好的治疗作用，但大多数注册的临床试验都没有达到预期的效果[2]。而且，在为期12个月的多中心临床随访研究中，有40％的患者输注MSC后没有临床反应[6]。在影响临床疗效的诸多因素中，功能失调的MSC的异质性细胞亚群组成可能是导致MSC治疗失败的不可或缺（甚至是首要）的因素。但是，关于MSC细胞亚群异质性目前仍然不太清楚。因此，深入认识并揭示MSC异质性并对其进行更具体准确的细胞亚群功能分析是提高患者对MSC治疗反应率的重要方向。

2023年1月4日，南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科孙凌云教授、北京协和医学院余佳教授课题组合作在Advanced Science 2023年第1期上正式发表了题为“Dissecting Heterogeneity Reveals a Unique BAMBI^high MFGE8^high Subpopulation of Human UC-MSCs”的研究论文。该研究对人脐带来源的MSC（UC-MSC）进行单细胞转录组测序并鉴定出3个细胞亚群C1、C2、C3。进一步揭示BAMBI^highMFGE8^highC1亚群具有独特的细胞表型和转录组图谱，并发现其成脂分化能力减弱，体内外免疫抑制功能受损。该工作对深入认识人UC-MSC的性质及未来选择理想的MSC细胞类型治疗疾病提供理论依据。

研究者首先采集了P0代和P7代的共六位新生儿（包括3男3女）的脐带华通氏胶MSC进行单细胞转录组测序（scRNA-seq）。再经过UMAP降维聚类分析将UC-MSC主要分为3个细胞亚群，命名为C1、C2和C3。进一步，对P0代各个细胞群中的细胞基因表达进行统计分析，展示了C1和C3细胞亚群之间差异表达的top20特异性基因，其中MSC标志物CD73、CD90和CD105在C1到C3之间几乎没有差异变化（图1）。这些结果揭示了脐带间充质干细胞的亚群组成，反映了不同细胞之间的异质性。

图1单细胞转录组分析揭示了P0代UC-MSC的异质性

（图源：Hongwei Chen et al., Adv Sci, 2023）

为了检测C1、C2、C3各亚群是否存在分化潜能偏好，研究者分析了单细胞测序中成骨标记COLA1A1、IGFBP3，成软骨标记DCN、LUM，以及成脂标记FABP5、MEST mRNA表达水平，发现C1具有较强的成骨成软骨分化潜能和较弱的成脂分化潜能，而C3具有较强的成脂分化潜能。接下来，在检测干细胞干性（Stemness）标记基因的表达水平过程中，发现C3亚群保持更好的干细胞特性。对MSC潜在的免疫调控功能进行检测，发现C1亚群高表达细胞因子CCL2、CXCL2、CXCL6和CXCL8。GSEA分析表明C1亚群富集IL6-JAK-STATS信号通路、细胞因子活性、补体活性以及急性感染反应等多种免疫调节相关通路（图2）。这些结果提示C1亚群具有非常规的抗炎作用。

图2 P0代UC-MSC亚群的单细胞转录组图谱特征

（图源：Hongwei Chen et al., Adv Sci, 2023）

为探明MSC在长时间培养后的异质性，研究者用上述同样的方法分析了P7代细胞，发现P7代MSC与P0情况相似，依然主要分为3个细胞亚群，并且其基因表达变化与P0相似，仅有少量不同。在体外长时间培养后，三个细胞亚群中C1、C3所占比例有所减少，C2有所增加（图3）。为了寻找有效区分C1-C3细胞亚群的细胞分选标记，研究者经过筛选发现在C1亚群中特异性高表达基因BAMBI和MFGE8。

图3 BAMBI^highMFGE8^high细胞富集在P0代和P7代间充质干细胞C1细胞亚群中

（图源：Hongwei Chen et al., Adv Sci, 2023）

在接下来的实验中，研究者利用免疫荧光染色检测MSC中BAMBI和MFGE8表达，确认两个分子在不同亚群的细胞中的表达水平和定位；进一步利用FACS流式分选出BAMBI^highMFGE8^highC1细胞亚群。实时定量PCR及Western Blot实验验证分选得到的C1亚群特异性高表达基因及蛋白的表达水平与scRNA-seq结果相似，如IGFBP5、BAMBI、CCL2。细胞增殖实验表明BAMBI^highMFGE8^highC1细胞增殖速度快于未分选的MSC细胞，而且C1亚群细胞直径明显小于non- BAMBI^highMFGE8^high细胞及未分选的MSC细胞。接下来进一步对C1细胞亚群进行microRNA及lncRNA测序，描绘了C1细胞亚群的转录组图谱（图4）。

图4 BAMBI^highMFGE8^high C1亚群细胞的分离及细胞表型特征鉴定

（图源：Hongwei Chen et al., Adv Sci, 2023）

进一步检测分析BAMBI^highMFGE8^high细胞亚群的分化能力，结果发现C1亚群高表达抑制成脂分化标记，如MEST、RBP1和BAMBI，而C3亚群高表达成脂分化标记，如FABP4、FABP5（图5）。成脂、成骨和成软骨定向诱导分化实验结果与单细胞测序结果一致，表明C1亚群细胞的成脂分化能力明显减弱。

图5 BAMBI^highMFGE8^high细胞成脂分化能力受损

（图源：Hongwei Chen et al., Adv Sci, 2023）

最后，在MRL/lpr狼疮模型小鼠中，分别尾静脉注射BAMBI^highMFGE8^highC1、non-BAMBI^highMFGE8^highMSC及未分选的MCS细胞进行治疗后，相比于其他组，PBS对照组与C1细胞亚群注射组SLE模型鼠的淋巴结、脾脏的重量没有明显减轻，尿蛋白没有减少，且病理结果表明小鼠肾脏的C3、IgG沉积明显（图6）。说明BAMBI^highMFGE8^highC1细胞亚群并未缓解MRL/lpr狼疮模型小鼠病情，该亚群对SLE无治疗疗效。

图6 BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC移植无法缓解MRL/lpr狼疮小鼠病情

（图源：Hongwei Chen et al., Adv Sci, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，研究者利用单细胞测序建立了一个新的广泛性的人脐带间充质干细胞转录组图谱，根据细胞自身的性质将脐带间充质干细胞分为3个亚群（C1-C3）。研究者进一步对BAMBI^highMFGE8^highC1细胞亚群的细胞学形态和功能学特征进行分析和鉴定，发现C1亚群成脂分化功能减弱，并且对MRL/lpr狼疮鼠治疗的免疫抑制作用减弱。此研究有助于明确脐带间充质干细胞的特性并能够在未来临床治疗特定疾病过程中选择合适类型的间充质干细胞提高治疗效率。尽管如此，该文章尚未研究BAMBI和MFGE8在间充质干细胞中所发挥的作用是否与其功能有关，而且对于脐带间充质干细胞的异质性的描述不够全面（未解析C2和C3亚群功能区别），存在一定局限性，需要进一步进行研究。

原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202202510

南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科陈洪伟副研究员为文章第一作者、温馨助理研究员和刘珊珊副研究员为共同第一作者；南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科孙凌云教授为文章第一通讯作者，北京协和医学院余佳教授为共同通讯作者。该研究成果由科技部国家重点研发计划，国家自然科学基金委重点项目、重点国际(地区)合作研究项目和江苏省重点研发项目资助。

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完