多细胞生物严密地协调自噬和细胞死亡，以维持发育、分化和许多细胞类型的稳态[1]。基于形态学、生化和分子机制差异，调节性细胞死亡主要分为凋亡形式和非凋亡形式[2]。铁死亡是一种非凋亡性细胞死亡，主要依赖于铁介导的Fenton反应和随后细胞内过量的脂质过氧化[3]。铁死亡损伤涉及多种病理情况，特别是癌症和组织损伤。GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）是system xc-的下游抗氧化酶，参与细胞膜中磷脂氢过氧化物的清除，从而对铁死亡具有细胞保护作用。抑制GPX4活性或下调GPX4表达可诱导铁死亡。虽然GPX4的抗铁死亡功能已被广泛研究，但GPX4的调控机制仍不甚清楚。铜是人体生理必需的微量元素，其代谢的改变与多种疾病发病密切相关。在大量不同类型的癌症患者中，包括淋巴瘤、乳腺癌和肺癌，都观察到血清和肿瘤铜水平升高。并且，铜螯合对肿瘤发展和血管生成具有潜在的抑制作用[4]。然而，过量摄取铜也会导致细胞损伤和死亡。特别是，细胞内铜的超生理水平通过诱导活性氧(ROS)或抑制蛋白酶体功能来触发凋亡[5]。此外，细胞内铜的积累可能导致一种特定的细胞死亡方式，称为“铜死亡”，其不同于凋亡、坏死和铁死亡[6]。在以往的研究报道中，铜似乎可以通过几种依赖于环境而不同的死亡途径来杀死细胞，但铜是否调节铁死亡尚未明确。
2023年1月09日，广州医科大学刘金保教授和陈鑫副研究员课题组以及美国德克萨斯大学西南医学中心Daolin Tang课题组合作在Autophagy上发表了题为“Copper-dependent autophagic degradation of GPX4 drives ferroptosis”的研究。该研究报道了铜在体外和体内促进铁死亡敏感性的新作用。首次证明了铜直接与GPX4蛋白结合，导致GPX4聚集体的形成和随后的GPX4自噬降解。另外还发现TAX1BP1（Tax1结合蛋白1）是GPX4蛋白降解的自噬受体。这些发现为自噬依赖性铁死亡的机制提供了新的见解。（拓展阅读：刘金保/陈鑫课题组相关研究进展，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：Exp Mol Med︱刘金保/陈鑫团队发现去泛素化酶STAMBP促三阴性乳腺癌进展新功能）为了确定铜是否调节铁死亡，作者使用铜螯合剂TM和TEPA处理四种胰腺癌细胞系Aspc-1、PANC-1、MIA PaCa-2和SW1990细胞，确定铜螯合剂TM和TEPA能够抑制铁死亡诱导剂erastin引起的细胞毒性（图1A）。并且，TM和TEPA对多种铁死亡诱导剂包括RSL3、erastin、ML162、ML210、SAS等诱导的细胞死亡均有抑制作用（图1B）。TM和TEPA只能抑制铁死亡而不抑制凋亡、坏死和碱死亡（图1C-F）。同时，作者发现TM和TEPA可以抑制erastin诱导的脂质过氧化，但对细胞内铁离子没有影响。与经典的铁死亡抑制剂liproxstatin-1和DFO不同，TM和TEPA在体外不具有抗氧化性，在体外也不能够结合铁离子。以上结果证明TM和TEPA可以抑制铁死亡。（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）作者在细胞培养基中添加铜离子之后，发现Cu2+会对低剂量的erastin处理造成细胞死亡(图2A)和脂质过氧化(图2B)，这一过程被铁死亡抑制剂Fer-1阻断(图2C)。当使用铁螯合剂DFO去除游离Fe2+时，向erastin中加入Cu2+并不能诱导细胞死亡(图2E)，说明Cu2+不能取代Fe2+介导Fenton反应(图2F)。作者进一步研究了Cu2+对GPX4蛋白表达的影响，结果显示，TM阻止了Erastin诱导的GPX4蛋白下调，而Cu2+则促进了GPX4蛋白下调(图2F,G)。同时，GPX4 mRNA水平不受影响(图2H,I)。重要的是，Cu2+联合erastin诱导了AsPC-1细胞GPX4蛋白的泛素化(图2J)，说明铜可能促进了GPX4蛋白的降解。既往研究表明，GPX4蛋白降解可通过蛋白酶体和自噬途径介导。随后作者发现只有自噬的抑制剂CQ可以阻止GPX4蛋白降解，而不是蛋白酶体BTZ(图2K)。铜还可以促进GPX4蛋白的多聚化(图2L)。因此，自噬可能参与了GPX4蛋白的降解。（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）作者推测自噬分子参与GPX4蛋白降解，作者发现铜和erastin的联合作用显著激活了自噬。此外，ATG5的下调也减弱了Cu2+联合erastin诱导的铁死亡（图3A）。紧接着作者发现Cu2+联合erastin选择性地增加了GPX4与TAX1BP1和SQSTM1的结合，但没有增加与其他自噬受体CALCOCO2、CCT2或OPTN的结合（图3B）。同时敲低TAX1BP1（而非SQSTM1/p62）抑制GPX4蛋白降解，并且降低了细胞对铁死亡的敏感性(图3C-E)。以上结果证明TAX1BP1是GPX4蛋白降解的关键自噬受体。（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）由于重金属诱导的ROS生成是细胞杀伤的重要机制，为了排除Cu2+介导的ROS生成参与这一现象的可能性，作者使用ROS清除剂NAC发现未能抑制Cu2+联合erastin诱导的GPX4聚集（图4A）。接下来，作者研究了Cu2+是否直接与GPX4结合以诱导GPX4聚集。为了验证这一假设，随后作者进行了基于重组GPX4蛋白荧光光谱的变化的研究，发现在Cu2+处理下GPX4发生了明显的光谱移位(从328 nm到334 nm)，这表明铜与GPX4之间可能存在直接的相互作用（图4B）。先前有研究发现Cu2+可与半胱氨酸残基相互作用，而GPX4中有两个表面可接近的半胱氨酸残基C107和C148，理论上可能与Cu2+结合。用丝氨酸残基取代这些半胱氨酸残基的位点定向突变表明，C107和C148都是Cu2+诱导的GPX4聚集在Cu2+联合erastin作用下发生的必要条件（图4C）。相比之下，未表面暴露的C75突变未能影响Cu2+诱导的GPX4蛋白聚集（图4C）。这些结果表明Cu2+选择性地与GPX4的半胱氨酸残基C107和C148结合。图4 铜诱导的GPX4聚集依赖于GPX4的半胱氨酸残基（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）作者进一步探究了铜对裸鼠在体移植瘤中铁死亡的影响。与细胞实验中的发现一致，相比对照组，PANC-1异种移植到IKE治疗，铜增强了IKE治疗效果，这种效果被铁死亡抑制剂Lip-1逆转（图5A-C）。免疫组化染色结果显示，铜离子和IKE联合使用对GPX4水平的抑制强于单一药物治疗（图5D）。此外，联合治疗增加了肿瘤中4-HNE的水平，但没有增加Cleaved caspase 3的表达水平（图5D）。然而，铜并不能影响erastin诱导的TFRC和Fe2+水平（图5D），说明铜并不影响肿瘤中与铁死亡相关的铁代谢。作者还评估了铜在急性胰腺炎中的作用，通过实验证明：铜有助于铁死亡诱导的急性胰腺炎。综上，这些结果证实了铜可以在在体内促进铁死亡的发生。（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）
综上所述，该研究揭示了铜离子的一种新的促铁死亡作用及机制，即铜离子与GPX4蛋白特定半胱氨酸残基的结合并促进依赖自噬受体TAXIBP1的GPX4自噬降解（图6）。作者的发现可能为通过给予额外的铜离子来增强癌细胞的铁死亡，以及通过铜离子螯合来抑制组织损伤性铁死亡提供潜在的治疗策略。
原文链接：https://doi.org/10.1080/15548627.2023.2165323
（照片提供自：广东省蛋白质修饰与降解重点实验室刘金保/陈鑫团队）
刘金保，博士，广州医科大学病理生理学教授。中国病理学会蛋白质修饰与疾病专委会主任委员，广东省蛋白质修饰与降解重点实验室主任。长期从事蛋白质修饰、降解与疾病的研究。获得教育部自然科学二等奖，广东省优秀教学成果二等奖，广州市科技进步一等奖和中华医学会科技三等奖各1项，发表SCI论文大于100篇。
陈鑫，肿瘤学博士，病理生理学副研究员，广州医科大学南山学者，广东省蛋白质修饰与降解重点实验室科研骨干。主要研究方向是细胞死亡的新型调控机制及相关药物的研发。近三年以第一/通讯作者身份在Nature Communications、Nature Reviews Clinical Oncology、Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology、Autophagy、Cell Death & Differentiation、Journal of Experimental Medicine等期刊发表细胞死亡相关论文。主持国家自然科学基金、省市级课题多项。
欢迎扫码加入岚翰生命科学：文献学习2
群备注格式：姓名-单位-研究领域-学位/职称/称号/职位
往期文章精选【1】Mol Ther-Nucl Acids︱黄建林/巫林平团队揭示靶向Hedgehog通路化学修饰siRNA有望治疗类风湿关节炎【2】NAR︱张亮/施蕴渝团队揭示线粒体核糖体结合因子hsRBFA辅助线粒体核糖体成熟的分子机理【3】刘翠华/汪静/张令强团队合作揭示泛素连接酶TRIM27促进肠道干细胞自我更新维持肠道稳态新机制【4】iScience︱枣庄学院徐萍科研团队揭秘曲克芦丁通过NEAT1干预辐射损伤的机制【5】Theranostics 综述︱多功能金属有机框架(MOFs)纳米平台用于癌症的单一和联合治疗【6】NAR︱方显杨团队揭示THF-II核糖开关的结构及其调控基因翻译的机制【7】Cell Rep Med｜苏佳灿/徐灿/陈晓团队合作揭秘炎症性肠病骨丢失机制【8】Adv Sci︱孙凌云/余佳团队发现有独特异质性的人脐带间充质干细胞BAMBIhighMFGE8high亚群【9】Exp Mol Med︱崔明/樊赛军/万国运团队合作克服益生菌治疗定植难题【10】Sci Adv︱李建龙等提出促进组织再生的新方案：神经激动剂-水凝胶复合体促进离子辐射损伤的唾液腺功能修复欢迎加入“岚翰生命科学” ”岚翰生命科学“ 诚聘副主编/编辑/运营岗位 (在线办公)
参考文献（上下滑动阅读）
1. Mizushima N, Levine B. Autophagy in mammalian development and differentiation. Nat Cell Biol 2010; 12:823-30.2. Tang D, Kang R, Berghe TV, Vandenabeele P, Kroemer G. The molecular machinery of regulated cell death. Cell Res 2019; 29:347-64.3. Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 2012; 149:1060-72.4. Ge EJ, Bush AI, Casini A, Cobine PA, Cross JR, DeNicola GM, et al. Connecting copper and cancer: from transition metal signalling to metalloplasia. Nat Rev Cancer 2022; 22:102-13.5. Chen X, Dou QP, Liu J, Tang D. Targeting Ubiquitin-Proteasome System With Copper Complexes for Cancer Therapy. Front Mol Biosci 2021; 8:649151.6. Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, Dreishpoon M, Verma A, Abdusamad M, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science 2022; 375:1254-61.
本文完