BMC Biol︱杭州师范大学程凯莹团队解析细菌NurA-HerA复合体的DNA末端切除机制

撰文︱孙亦阳，王  莹，郝万山审阅︱程凯莹，王思珍责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

同源重组（Homologous Recombination, HR）在基因组双链断裂（Double-Stranded Break, DSB）修复中以高保真的方式发挥着重要作用。在古菌中执行这一任务的主要是核酸酶NurA和ATP依赖的的转位酶HerA。古菌的NurA-HerA复合体介导了DSB DNA末端的切除，并且生成了用于匹配源序列的游离3’末端。虽然目前古菌的NurA和HerA结构已得到解析，但关于其DSB DNA末端切除的相关分子调控机制研究仍十分有限。在细菌中也发现了编码NurA-HerA蛋白的基因，其与古菌的蛋白序列一致性低于20%。目前关于细菌NurA-HerA复合体的生物学功能仍存有争议，其结构和生化活性研究较少，NurA-HerA在细菌DSB DNA末端切除中的详细机制研究尚处空白。

2023年2月24日，杭州师范大学程凯莹教授课题组在BMC Biology上发表题为“Structural and DNA end resection study of the bacterial NurA-HerA complex”的研究。该研究首次解析了耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans, dr）HerA的晶体结构并依靠低分辨冷冻电镜数据构建了一个drNurA-HerA-DNA复合物的模型，同时，结合生化实验分析，鉴定了其各亚基互作以及发挥功能的关键氨基酸残基，阐述了其对DSB DNA的5’端进行特异性切割并产生游离的重组型3’单链DNA末端的可能机制。该研究为解析细菌NurA-HerA复合体介导的DSB DNA末端处理机制提供了新的见解。

该研究首先通过X射线衍射和低分辨率冷冻电镜解析了drHerA的结构，数据显示drHerA无论在是否结合核苷酸的情况下都形成稳定且形态类似的六聚体（图1A，B）。每个drHerA包括三个结构域：N端的HAS桶状结构域，其形成了底物DNA的出口；RecA样ATP酶结构域；螺旋束结构域，它插入了RecA样ATP酶结构域内部并形成了底物DNA的入口。在RecA样ATP酶结构域内部还鉴定到一个保守的HerA/FtsK家族dsDNA特异性易位相关基序（TR motif）（图1C）。根据低分辨冷冻电镜密度图，利用解析的drHerA结构和AlphaFold2预测的drNurA结构，获得了drHerA-NurA复合物的模型（图1D）。与古细菌型NurA相比，drNurA显示出不同的二聚化形式。

图1. drHerA及drNurA的结构总览

（图源：Yang J, et al., BMC Biol , 2023）

与古菌NurA-HerA一样，drHerA与drNurA之间的相互作用对于它们进行正常的生理活动亦是必不可少的。古菌NurA和HerA的互作主要由一些疏水相互作用介导，一个NurA分子以不同部位分别结合三个HerA分子。而对drHerA与drNurA互作界面的分析发现， drHerA的互作部位带高负电荷，drNurA的互作部位带高正电荷，同时，一个drNurA分子可以利用不同部位分别结合四个drHerA分子（drHerA六聚体中有两个亚基同时被两个drNurA结合）（图2）。利用点突变和凝胶排阻层析实验找到了关键互作位点——drHerA上的三个保守的带负电氨基酸残基，以及drNurA上的四个带正电荷的保守基序。这些数据提示细菌NurA-HerA和古菌NurA-HerA有着不一样的互作模式。

图2. drNurA-HerA互作界面分析

（图源：Yang J, et al., BMC Biol , 2023）

drNurA-HerA-dsDNA复合物的结构模型显示，虽然drHerA六聚体的孔隙大小足以允许dsDNA通过，但drNurA二聚体形成的孔隙对于完整的DNA双螺旋来说太窄，双链DNA只有在被解离成单链后才可能进入drNurA的催化位点（图3）。随后的生化数据表明，drNurA亚基上的一个针状基序对于dsDNA的解开是必不可少的。

同时，研究还找到了drHerA上与dsDNA转位相关的保守残基，R552和R495，他们分别位于环状转位酶共有的一个保守基序以及HerA/FtsK家族dsDNA特异性易位相关基序上，两者距离为~14Å，约等于dsDNA的大沟宽度（图3），因此，推断这两个残基很可能分别结合并负责其中一条DNA的转位，如此便可以保证dsDNA的两条链同时顺利转位。

此外，核酸酶实验还发现，转位状态下的drNurA-HerA复合体偏好水解5’端DNA链，而静止状态下的复合体对3’端DNA链也有水解活性。推测是由于转位状态下的drHerA结构发生连续变化，连带着drNurA的结构发生变化，从而影响了其酶切活性，这种转位依赖的酶切活性调控机制可以帮助解释NurA-HerA在体内处理DSB时，特异性降解5’端DNA链，为同源重组提供游离3’单链DNA末端的分子机制。

图3. drNurA-HerA-dsDNA复合物结构模型

（图源：Yang J, et al., BMC Biol , 2023）

然而，drNurA-HerA的生物学功能还存在着争议，表型实验表明，drNurA-HerA复合物能削弱菌体对DNA损伤剂的耐受，这种情况在嗜热栖热菌的DNA损伤修复研究中也有被观察到，这说明细菌与古菌的NurA-HerA复合物可能在生物学功能上也有差异。

图4. drNurA -HerA复合体的DNA末端切除模型

（图源：Yang J, et al., BMC Biol , 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究提供了关于细菌NurA-HerA复合物的一些新见解。除了序列一致性较低外，观察到细菌和古菌的NurA-HerA复合物在结构上有显著不同，drHerA形成的稳定六聚体形式和更大的DNA结合通道提示它与古菌HerA的DNA加载机制不同，drNurA上的一个额外的针状基序提示它与古菌NurA的DNA解链机制不同，同时drNurA-HerA与古菌NurA-HerA有着不同的结合方式。由于在研究中没有得到稳定的drNurA-HerA-DNA复合体，因此很难在分子水平上准确描述复合体的调控机制，但在诸多生化数据的支撑下，该研究提出了一个关于该复合体的组装、装载、转位、DNA解链和末端切除机制的合理假设，即：NurA-HerA复合物识别并结合在断裂的DNA末端后，ATP的水解使得HerA六聚体以螺旋阶梯状形式在DNA上发生转位，NurA二聚体上的针状基序负责打开DNA双链，同时，HerA在转位过程中的构象变化将引起NurA的构象变化，转位进行中的NurA构象偏好行使DNA 5’末端内切酶活性，使得dsDNA的5’末端被持续水解，并产生长的3’单链DNA末端用于随后的同源重组修复（图4）。

原文链接：https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-023-01542-0

杭州师范大学为该论文的研究单位，团队讲师杨婕妤和研究生孙亦阳为文章的共同第一作者，程凯莹教授为文章的通讯作者。该研究受到了浙江省衰老与癌变生物学重点实验室的支持，受国家自然科学基金（32270043、32100017和32200146）、浙江省自然科学基金（LQ22C050002）、杭州师范大学人才启动基金（4125C50221204040和4255C50222204016）的资助。

第一排（左起）：郝万山，孙亦阳，王莹；第二排（左起）：程凯莹，杨婕妤

（照片提供自：程凯莹团队）

作者简介（上下滑动阅读）

第一作者：杨婕妤，杭州师范大学基础医学院讲师。主要以酶学和结构生物学为手段，研究病原微生物聚合酶的催化与调控机制，曾在国际学术期刊Nucleic Acids Research发表一作论文，解析了首个蜱传黄病毒聚合酶的三维结构，揭示了RNA病毒聚合酶潜在的宿主适应热点区域，为病毒RNA聚合酶的调控机制及RNA聚合酶相关的宿主适应研究提供了重要线索。现主持一项国家自然科学基金。

共同第一作者：孙亦阳，杭州师范大学基础医学院研究生。

通讯作者：程凯莹，杭州师范大学基础医学院教授。长期从事细菌DNA损伤修复和复制机制的研究，尤其在细菌的同源重组修复机制以及SOS响应蛋白的分子机制方面有较多突破，发表多篇相关SCI论文，其中以第一或通讯作者在Nature Structural & Molecular Biology、Elife、Nucleic Acids Research、mbio、BMC biology等期刊发表论文10余篇，发现并阐释了多种细菌关键DNA损伤响应和修复蛋白的催化和调控机制，为新型抗生素的研发提供了理论依据。现主持多项国家自然科学基金和浙江省自然科学基金。

课题组接收生化与分子生物学方向硕士生和博士生，欢迎感兴趣的同学报考。

欢迎加入岚翰生命科学：文献学习2

扫码添加微信，并备注：岚翰-文献-姓名-单位-研究领域-学位/职称

往期文章精选【1】BMC Biol | 中科院动物所杜卫国/周旭明团队合作探讨丽斑麻蜥高原适应的基因组变异【2】J Transl Med︱俄亥俄州立大学吴庆团队新研究：基因组范围的多基因风险评分可预测绝经后妇女骨质疏松性骨折风险【3】STTT丨湖北工业大学唐景峰/复旦大学汪振天团队合作揭示胰腺癌新机制【4】Commun Biol︱首都医科大学高伟/江梦溪课题组利用空间转录组学分析小鼠肝缺血再灌注分区损伤模式【5】iScience︱济宁医学院附属医院陈明台团队揭示西达本胺调控骨髓间充质干细胞成脂分化的新作用【6】Clin Transl Med︱耶鲁大学刘延盛团队通过磷酸化蛋白质组学揭示二甲双胍在结直肠癌细胞中的作用机制【7】CDD 综述︱华中科技大学张磊等评述T细胞在特发性肺纤维化中的作用【8】Research︱清华大学欧阳证/马潇潇团队利用结构脂质组学技术揭示乳腺癌细胞的单不饱和脂质代谢重塑【9】Nat Commun︱李鑫/赵辛团队合作报道羊膜动物利用固有的遗传不稳定性来保护种系基因组的完整性【10】Aging Res Rev 综述︱退行性关节疾病发病机制的新见解：RNA结合蛋白在椎间盘退变和骨性关节炎中的作用优质科研学习课程推荐【1】R语言生信数据分析及可视化作图（网络）研讨会（3月3-5日，腾讯在线会议）【2】宏基因组与代谢组/脂质组学R软件数据可视化研讨会（延期至2023年3月25-26日，腾讯在线会议）【3】全国循证医学Meta分析与网状Meta研讨会（2023年3月4-5日，腾讯在线会议）
欢迎加入“岚翰生命科学” ”岚翰生命科学“ 诚聘副主编/编辑/运营岗位 (在线办公)

本文完