内质网应激（ER stress）是由于内源或外源的刺激（如Ca2+稳态的破坏、病毒感染和氧化还原平衡等）导致内质网中错误折叠蛋白的积累而引发。为了应对细胞遭受的内质网应激，细胞会产生未折叠蛋白反应（Unfolded protein response, UPR）[1]。细胞通过启动UPR来抑制翻译过程，减弱蛋白质合成从而减轻内质网蛋白合成负担、同时促进内质网分子伴侣蛋白的表达，增加内质网折叠蛋白质的能力来清除未折叠/错误折叠的蛋白质，最终帮助细胞应对压力从而促进细胞存活。而UPR感受器为三种内质网跨膜蛋白，包括IRE1蛋白（Inositol-requiring enzyme 1）、PERK蛋白（PKR-like ER resident kinase）和ATF6蛋白（Activating transcription factor 6α），其中IRE1α是最保守的以及研究最广泛的UPR信号分支。TMCO1（Transmembrane and coiled-coil domains 1）是内质网上钙离子过载激活的离子通道。TMCO1对于内质网钙离子稳态的维持十分重要，TMCO1敲低或缺失会导致内质网中钙离子过载。当内质网的钙离子过载时，可以形成钙离子通道CLAC（Ca2+ load-activated Ca2+），将内质网中过多的钙离子排出，从而维持胞内钙离子稳态。人类TMCO1蛋白的缺失会导致颅面胸发育不良（CFTD, cerebro-facio-thoracic dysplasia），十几年来，TMCO1蛋白经历了漫长的研究过程，其蛋白功能表现得强大而广泛，在骨质疏松[2]、肿瘤[3]、卵巢早衰[4]、胼胝体发育[5]以及糖尿病牙周组织再生[6]中发挥着重要作用。内质网作为细胞内主要的钙库，对蛋白质折叠、分泌和Ca2+稳态至关重要。众所周知，内质网中的Ca2+耗竭可导致内质网功能障碍并激活UPR，ER Ca2+过载发生在包括阿尔茨海默病在内的多种疾病中[7, 8]，靶向细胞内Ca2+储存可能具有治疗这些疾病的潜力。目前，当内质网中Ca2+过载时，UPR传感器是否以及如何响应过量的Ca2+仍不清楚。2023年7月3日，中国科学院动物研究所唐铁山团队和北京基因组所郭彩霞团队在Cell & Bioscience上发表了题为“ER Ca2+ overload activates the IRE1α signaling and promotes cell survival”的文章，揭示了内质网钙过载在UPR激活过程中的重要作用，发现TMCO1是IRE1α的一个新调节因子，为进一步理解IRE1α活化提供了新的见解。（拓展阅读：唐铁山/郭彩霞课题组，详见“岚翰生命科学”姊妹号“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Cell Biosci 综述︱唐铁山团队评述染色质重塑在神经发育和神经退行中的作用、机制及小分子调控；Cell Death Dis︱唐铁山/郭彩霞团队揭示TMCO1缺失影响胼胝体发育的机制）
课题组之前的研究表明，在小鼠卵巢颗粒细胞中，TMCO1蛋白的缺失会出现内质网应激的现象[4]，并特异性激活IRE1α信号分支，但是背后的机制并不清楚。作者为了研究TMCO1对IRE1α信号通路的影响，探究了TMCO1在UPR中的作用。作者发现在本底情况下，敲低TMCO1可以增加IRE1α蛋白的表达，促进IRE1α的激活，以及IRE1α下游信号XBP1的mRNA切割即XBP1s蛋白的上调（图1A和C），值得注意的是，当细胞受到毒胡萝卜素（TG）挑战时，敲低TMCO1抑制了PERK和ATF6的活性（图1B）。这些结果表明，TMCO1缺失可导致活跃的内质网应激通路，并且主要由IRE1α介导，而不是PERK或ATF6。图1 TMCO1敲低导致IRE1α通路的激活以及下游信号的上调（图源：Zhao S et al., Cell Biosci, 2023）考虑到TMCO1缺失可导致ER Ca2+过载，作者想知道异常Ca2+信号是否在TMCO1敲低（KD）细胞中的IRE1α激活中起作用。作者注意到TMCO1 KD细胞中IRE1α磷酸化水平和XBP1s蛋白表达的增加在很大程度上被Ca2+螯合剂BAPTA-AM消除了(图2A)，表明TMCO1缺失引起的IRE1α的激活可能归因于细胞内Ca2+水平的改变。为了进一步确定TMCO1缺失是否会在内质网应激诱导下使IRE1α-XBP1通路敏感，以及Ca2+信号是否参与这一过程，作者将野生型（WT）和TMCO1 KD细胞分别暴露于三种不同的内质网应激源，包括tunicamycin (TM)、TG或DTT。实验结果表明，在三种内质网应激源刺激的情况下，都可以显著增加WT和TMCO1 KD细胞中XBP1s的mRNA(图2B, D和F)和蛋白质(图2C, E和G)水平，TMCO1 KD细胞比WT细胞增加更明显。有趣的是，与BAPTA-AM同时处理几乎完全消除了内质网应激源引起的XBP1s的增加。这些数据表明，TMCO1敲低细胞以钙离子依赖方式活化IRE1α-XBP1通路来响应外源刺激。图2 TMCO1通过Ca2+信号调节IRE1α的激活（图源：Zhao S et al., Cell Biosci, 2023）由于TG会导致内质网钙离子瞬时释放而TM和DTT不能，但是钙离子螯合剂BAPTA-AM均可以消除TM、DTT以及TG处理导致TMCO1 KD细胞中IRE1α-XBP1通路的活化作用。对于这三个内质网应激诱导剂而言，在诱导TMCO1 KD细胞中内质网应激时，唯一相同的内环境就是TMCO1敲低诱导内质网内钙过载。因此，作者推测TMCO1敲低激活IRE1α信号与内质网内钙离子的过载有关。基于课题组之前的研究结果[9]，作者构建了一个缺乏Ca2+通透功能的TMCO1突变体(D140A)。结果表明，TG处理后TMCO1 KD细胞中Ca2+释放的增加可以通过表达WT TMCO1而不是D140A突变体来恢复，这表明TMCO1对Ca2+信号的调节取决于其Ca2+通透性(图3A和B)。有趣的是，作者发现外源表达WT TMCO1而不是D140A突变体可以恢复TMCO1 KD细胞中IRE1α的磷酸化水平(图3C)和XBP1s的表达(图3C和D)。这些数据清楚地表明，ER Ca2+超载对于TMCO1在IRE1α活化中的调节作用至关重要，并且IRE1α的活化与ER中Ca2+过载状态密切相关。图3 ER Ca2+过载敏化IRE1α-XBP1信号轴（图源：Zhao S et al., Cell Biosci, 2023）BiP是IRE1α的负调节因子，其与IRE1α的腔域(LD)的解离是IRE1α活化所必需的。然后作者研究了ER Ca2+过载是否会影响BiP和IRE1α之间的相互作用。已有研究报道BiP与IRE1α之间的关联是由BiP中的核苷酸结合域（NBD）和IRE1α的LD以核苷酸不依赖的方式介导的[10]。因此，作者分别纯化了GST-BiP-NBD和IRE1α-LD-Flag，并在不同浓度的Ca2+存在下进行了GST下拉实验。结果表明，BiP-NBD与IRE1α-LD之间的相互作用只能被1.2 mM Ca2+破坏，而不能被0.8/0.5 mM Ca2+（静息状态下内质网腔内钙离子浓度）破坏(图4A和B)，这表明BiP-NBD与IRE1α-LD的结合依赖于Ca2+，并且只有超出生理范围的Ca2+才能破坏BiP与IRE1α之间的相互作用。为了进一步支持这一点，作者还模拟了ER Ca2+过载环境对BiP和IRE1α之间相互作用的影响。为此，用CDN1163（SERCA泵激动剂）或2-APB（IP3Rs拮抗剂）处理HEK-293 T细胞，TG作为阴性对照。正如预期的那样，TG降低了ER Ca2+水平，而CDN1136和2-APB增加了ER Ca2+水平(图4C和D)。同时，免疫沉淀结果显示，TG或CDN1136/2-APB处理显著降低了BiP与IRE1α的互作(图4E和F)，表明ER中Ca2+的耗竭或过载都可以减少BiP与IRE1α的相互作用。综上所述，这些结果表明，TMCO1缺失引起的ER Ca2+过载可以减少BiP与IRE1α的结合，并促进IRE1α的激活。图4 ER Ca2+过载破坏BiP和IRE1α之间的相互作用（图源：Zhao S et al., Cell Biosci, 2023）鉴于XBP1剪接的促存活特性[11]，作者探究了TMCO1缺乏诱导IRE1α活化是否能促进细胞存活。结果显示，虽然敲低TMCO1可在一定程度上促进细胞死亡，但KIRA6特异性抑制IRE1α通路可显著促进细胞死亡，且在TMCO1 KD细胞中的作用明显高于WT细胞(图5A和B)。具体而言，在基础条件下，TMCO1 KD细胞诱导的早期和晚期凋亡(坏死期)细胞比例均高于WT细胞，而在KIRA6处理下，TMCO1 KD导致的晚期凋亡细胞明显多于WT。这些结果表明，IRE1α-XBP1轴的活化可以帮助TMCO1 KD细胞在ER Ca2+过载时存活。该研究从机制上阐明了ER Ca2+过载减少了BiP和IRE1α之间的相互作用，从而增强了IRE1α-XBP1通路，进而促进细胞存活（图6）。（图源：Zhao S et al., Cell Biosci, 2023）图6 TMCO1缺失引发的ER Ca2+过载导致IRE1α激活模式图（图源：Zhao S et al., Cell Biosci, 2023）内质网钙稳态决定细胞钙信号触发的准确性。同时，由于内质网是蛋白质合成和加工的场所，钙稳态在内质网蛋白的正常折叠成熟过程中也有重要作用。已有证据表明内质网钙水平降低可以诱发UPR，但内质网钙过载是否引起UPR还是个迷。本论文以课题组前期的TMCO1敲除小鼠为模型，研究了内质网钙过载情况下的UPR应激反应。发现内质网钙离子超载可以直接敏化内质网应激下的IRE1α-XBP1信号轴。从机制上发现TMCO1缺陷细胞中过载的内质网钙离子可导致BiP从IRE1α中解离，促进IRE1α蛋白的二聚化和稳定性，并促进IRE1α的激活。进一步发现内质网钙过载诱导的IRE1α的激活有利于细胞抵抗早期凋亡向晚期凋亡的进程，利于细胞存活。本研究建立了内质网钙离子过载引起的内质网应激模型，并确定TMCO1是IRE1α的新型调节因子，为进一步理解IRE1α激活提供了新见解。相关结果有助于阐明内质网钙稳态失衡及相关疾病的机制，有创新性和潜在应用价值。不足之处，关于钙离子影响Bip-IRE1α互作的具体机制，还需进一步研究。
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https://doi.org/10.1186/s13578-023-01062-y中国科学院动物研究所博士生赵松（已毕业）、博士生冯海平和博士生蒋东方为论文的共同第一作者，动物研究所刘红美副研究员、北京基因组所郭彩霞研究员和动物研究所唐铁山研究员为共同通讯作者。该研究得到了国家自然基金委项目的支持。
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