干货分享 | 基因毒性杂质的法规、来源、检测、控制（第一期）
基因毒性杂质的定义和相关法规
Definition
定义
1
遗传毒性
基因毒性
致突变性
致癌性
基因毒性杂质的研究已经引起越来越多的关注（图1），但对于遗传毒性（genotoxicity）、致癌性（carcinogenicity）和致突变性（mutagenicity）等术语，常常有误解和混淆。
图1 逐年增加的基因毒性研究
遗传毒性（Genotoxcity）又称为基因毒性，是指遗传物质中任何有害变化引起的毒性，而不考虑诱发该变化的机制，其涵盖了广泛的遗传损伤，这种对遗传物质的损伤有可能通过细胞DNA修复机制得到纠正。
遗传毒性杂质（GenotoxicImpurities，GTIs）是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其它类型的非致突变性杂质。
致突变性遗传毒性杂质，指直接作用于DNA，引起遗传物质改变的物质，通常由标准的细菌回复突变试验（Ames试验）结果判定。
非致突变性遗传毒性杂质不直接作用于DNA（Ames阴性），一般引起染色体畸变，通常为阈值机制，即化合物剂量与效应之间的关系不完全是线性的，在浓度达到一定阈值后才产生相应的毒性作用。阈值机制的存在可能是化合物在与DNA接触前即被降解失活，或产生的损伤一定程度内可被有效修复。非致突变性遗传物质可按照一般物质进行评估（PDE）。
致癌性（Carcinogenicity）由动物致癌试验结果和人类致癌性相关证据判定。目前，一般将致癌物分成两大类：一类是遗传毒性致癌物（genotoxic carcinogens），大多数的化学致癌物具有遗传毒性；第二类是非遗传毒性致癌物或称为外遗传性致癌物（nongenotoxic carcinogens or epigenetic carcinogens），通常不与DNA发生化学键合作用，不对DNA产生直接破坏，而是通过遗传物质外的间接机制引起致癌作用（如促进细胞过度增殖等），这类致癌物在致突变试验（如试验）中一般呈阴性结果。
图2 致突变性与致癌性的关系
简而言之，致突变试验是依据大多数致癌物具有致突变性而大多数非致癌物无致突变性来对受试物进行致突变检测。筛检阳性的受试物可能是具有遗传毒性的致癌物，也可能是具有遗传毒性的非致癌物；阴性的受试物可能是非遗传毒性的非致癌物，还有可能是非遗传毒性的致癌物。
图3 致癌物与遗传毒性物质的关系简图
值得注意的是，ICH M7和中国药典对于基因毒性杂质的相关法规均关注致突变机制的遗传毒性杂质，非致突变机制的遗传毒性杂质以一般杂质水平存在时，通常可忽略其致癌风险。
图4 遗传毒性致癌物警示结构示例
图5 非遗传毒性致癌物警示结构示例
Development history of regulations
法规发展历程
2
ICH Q3 1995年
ICH Q3 使用术语“异常毒性（unusual toxicity）”，其中包含很多基因毒性杂质，但术语“基因毒性（genotoxic）”尚未被使用。
l PharmEuropa 2000年
2000年，欧洲药典首次公开披露基因毒性杂质的特定监管问题，提出磺酸在醇溶液中成盐可能产生磺酸酯类杂质。
CPMP 2002
2002年，CPMP（Committee for Proprietary Medicinal Products, 欧洲专利药品委员会），现为CHMP（Committee for Human Medicinal Products，人用药品委员会），发布《Position paper on the limits of Genotoxic Impurities》，要求对基因毒性杂质形成的不可避免性提供合理的论据，提出阈值机制和线性机制，需要对遗传毒性杂质进行质量（Quality）和安全性（Safety）评估，包含体内试验，并提出了“技术上尽可能低（as low as technically feasible）”的理念。
CHMP 2004
2004年， CHMP发布《Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities（draft）》，提出ALARP（As Low As Reasonably Practical，合理可行的最低程度）原则和TTC (Threshold of Toxicological Concern)毒理学关注阈值概念。
EMA 2006
2006年EMA颁布《Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities》。
PhRMA 2006
2006 年 PhRMA（Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，美国药品研究和制造商协会）以意见书的形式公开发表对遗传毒性杂志的讨论成果，引入了两个重要的创新理念：临床实验材料的分期 TTC 概念；遗传毒性杂质的五级分类系统，将定量构效关系（Quantitative Structure Activity Relationships, QSAR）评估作为遗传毒性杂质风险评估的第一步。这份意见书的制定和 EMA 相关官方指南的制定举措同时进行， 结果导致方法有部分重叠，因此， 这两个文件在方法和侧重点上互为补充。PhRMA 文件使用了 EMA 中TTC的概念， 而 EMA 最终版指南中推荐了由 PhRMA提出的分期 TTC 方法。
图6 PhRMA 白皮书
l SWP Q&A 2008
2008年由CHMP安全工作组（SWP）发布Q&A，在Muller提出的TTC持续时间基础上进行了调整，并指出术语cause of concern指具有预先存在或新的遗传毒理学指标的材料，并提出决策树。
图7 决策树
EDQM 2008
2008年EDQM （European Directorate for the Quality of Medicines）进一步阐明术语cause of concern，指出在没有实际毒理学数据的情况下，警示结构本身并不构成“cause of concern”，并提出多基因毒性杂质的控制策略，并将ALARP移除。
l FDA 2008
2008年，FDA发布《Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substance and Products: Recommended Approach》内容和EMA指南基本一致，主要区别在于对GTI下限的要求。FDA采用了额外的安全系数3，而EMEA采用了系数10，阶段化TTC稍有不同。针对已知或可疑的潜在基因毒性和致癌杂质的安全认证提出具体建议。规定当杂质含量超出ICH质控限度时，若无充分的文献或研究数据支持，则需按ICH的试验方案进行基因毒性评价；当杂质含量低于ICH质控限度时，应采用(Q)SAR方法进行毒理学评估；对具有警戒结构的杂质，采用Ames进行研究。
图8 FDA 指南
ICH M7 2014
2014年，ICH年发布《M7 Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk》，2015年，公布M7（R1）Addendum. 目前M7（R2）的修订工作正处于step 2阶段，2020年发布M7（R2）R&A，2021年Addendum to M7(R2)（draft）（step 2 version）。
国内
●2007年发布药物遗传毒性研究技术指导原则。
●2020年，中国药典2020版四部通则9306 遗传毒性杂质控制指导原则正式公开。
●2020年，关于公开征求ICH《M7：评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险》问答文件草案及其支持文件意见的通知。
●2021年，国家药监局药审中心发布公开征求ICH指导原则《M7（R2）：评估和控制药物中的DNA活性（致突变）杂质以限制潜在的致癌风险》意见的通知。
参考文献
1. 遗传毒性杂质控制指导原则
2. ICH M7
3. 遗传毒性杂质警示结构，马磊等，中国新药杂质 2014年23卷第18期。
4. CHMP 《Position paper on the limits of Genotoxic Impurities》
5. EMA 《Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities》
6. PhRMA A rationale for determining, testing, and controlling specific impurities in pharmaceuticals that possess potential for genotoxicity
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