干货分享 | 基因毒性杂质的法规、来源、检测、控制（第六期）
1 亚硝胺的关注历史
过去三四年中，亚硝胺类致癌物引起了药物监管机构的特别关注，不少药品的召回均与之有关。然而，亚硝胺的致癌潜力由来已久。在挪威，1957年和1970年报告了农场动物肝脏疾病和癌症的暴发。调查显示，在鲱鱼粉中用作防腐剂的亚硝酸钠导致了强致癌物二甲基亚硝胺的形成。2002年，12名日本患者因食用中草药膳食补充剂而发生肝损伤。该补充剂的主要成分是麻黄生物碱、甲状腺激素和芬氟拉明。对膳食补充剂进行的仔细化学研究表明，存在具有肝毒性的合成化学物质N-亚硝基芬氟拉明。
而在医药行业，过去几年亦发生了多起因为亚硝胺的召回事件：
FDA在缬沙坦
中发现NDMA
022019.09
FDA在雷尼替丁和
尼扎替丁中发现NDMA
032019.12
FDA在二甲双胍
中发现NDMA
<右滑查看更多内容>
FDA数据库显示，由于致癌N-亚硝胺杂质的含量超过26.5 ng/天的可接受摄入量限值，已从市场召回1400多个产品批次。召回产品中的药物包括缬沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、二甲双胍、雷尼替丁和尼扎替丁。
图1 FDA官网上关于亚硝胺的最新消息
2 亚硝胺的形成
亚硝基化合物是指含有“-N=O”基团的一类化合物，主要包括亚硝胺，亚硝酰胺和亚硝脲，由亚硝化试剂与胺、酰胺、脲反应生成。其中亚硝胺为亚硝化试剂与胺生成的一类物质。
图2 亚硝基化合物的来源
单就亚硝胺而言，除了从胺反应生成，亦可以从以下几种途径生成。
图3 亚硝胺的生成途径
酰胺的金属化物与NO（气体）的反应，如途径a所示。
N-硝基衍生物的还原，如途径b所示。
肼和腙类化合物的氧化，如途径c所示。
N-亚硝基化合物亦通过各种其他途径，如途径d所示。
上述这4种途径都比较少见，最常见的是胺与亚硝化试剂的反应，生成亚硝胺的两个关键要素是胺和亚硝化试剂的存在。
胺从结构上看可以分为伯胺、仲胺、叔胺、季胺。上述四种胺均有可能与亚硝化试剂反应生成亚硝胺。
伯胺
通常，伯胺生成的亚硝胺不稳定，很容易进一步降解，芳胺的亚硝化产物会降解为芳香胺和芳香二氮鎓盐，而脂肪胺的亚硝化物则降解为脂肪胺和脱氨基产物（例如醇、醚、烯烃等）。
仲胺
仲胺的N-亚硝化是迄今为止研究最广泛的。仲胺与大多数亚硝化剂的反应速率不同，这取决于结构或物理化学因素，如它们的pKa和靠近氮原子的空间环境。
药物生产过程中最常用的肿胺为二甲胺，可以生成二甲基亚硝胺。
叔胺
叔胺只有在含有α-H时，才能生成亚硝基化合物，其反应原理，如下图所示。
图4 叔胺的亚硝化过程
一般来说，叔胺的反应性比仲胺低得多（据报道，反应性要低1000倍以上），因为它们需要额外的脱烷基步骤，α-CH键断裂被认为是速率决定步骤。对于不对称叔胺，存在一系列产品的可能性。
图5 不对称叔胺可能产生的亚硝胺类物质
叔胺产生亚硝胺的一些例子如下图所示：
图6 （二甲氨基甲基）吡咯、2-二甲氨甲基吲哚、溴己新的亚硝化反应
需要特别注意的是，很多叔胺中还有肿胺杂质，这些肿胺杂质也是亚硝胺基因毒性杂质的前体，如三乙胺中可能含有二丙胺和异丙基乙胺杂质。
季胺
季胺亦可以与亚硝化试剂反应生成亚硝胺，Fiddler等于1972年发表于Nature的文章报道了季胺与亚硝化试剂反应的研究，如下表所示。
从上表可以看出，季胺反应生成亚硝胺的量远低于叔胺。
需要特别注意的是，除了季胺本身的反应，季胺中可能含有的肿胺、叔胺杂质也可能是亚硝胺类基因毒性杂质的来源。如常用的相转移催化剂四丁基溴化铵，其中可能含有三叔丁基胺和二叔丁基胺杂质。
酰胺
实验过程中使用的酰胺类溶剂是肿胺的另一个来源。这类酰胺溶剂有DMF，DMA（N,N-二甲基乙酰胺），N,N-二乙基乙酰胺、NMP（N-甲基吡咯烷酮）等。这些酰胺类有机溶剂本身可能含有相应的肿胺类杂质，同时它们在合适的条件下又可以发生分解，生成相应的肿胺。
图7 酰胺类溶剂以及对应的肿胺
2.2 亚硝化试剂亚硝酸钠是重要的亚硝化试剂。在酸性条件下，亚硝酸盐转化为亚硝酸，进一步分解为亚硝基离子（NO+）。
图8 亚硝基离子生成机理
其他一些亚硝基离子的前体，如下图所示：
图9 亚硝化试剂
亚硝化试剂，如亚硝酸钠一般用于NaN3的淬灭，沙坦类药物中亚硝胺的产生就是由于使用亚硝酸钠淬灭叠氮钠引起的。
需要警惕的是其他试剂中可能含有亚硝酸盐杂质，如叠氮钠中可能含有亚硝酸铵，硝酸盐类试剂中也可能含有亚硝酸盐类。
需要注意的第二点是，亚硝化试剂的残留，即便亚硝化试剂的引入在工艺前期，而胺在后期使用，亦应该注意亚硝化试剂在工艺流程中残留导致亚硝胺类物质的生成。
需要注意的第三点是，亚硝化试剂可能存在很多工艺试剂中，甚至水中，氯胺是重要的水消毒剂，它同时也可以引起亚硝基化合物的生成。
3 亚硝胺的致癌机理
亚硝胺本身没有致癌性，其致突变性和致癌性的产生主要依赖于体内的代谢活化以及自身在生理pH值下分解。代谢活化主要通过细胞色素P450依赖性酶，在该酶的作用下，亚硝胺发生α-羟基化，并进一步重排或者氧化，消除一分子醛，并最终都产生高度反应性的碳阳离子或重氮化合物，它们能够与各种细胞大分子，如DNA、RNA和染色体等发生烷基化反应。
图10 亚硝胺的致突致癌机理
4 亚硝胺的毒性
IARC
世界卫生组织的国际癌症研究机构（IARC），根据亚硝胺对人类的致癌潜力对其进行了分类。根据IARC专著，这些药物分为四类（图11）。第1组内的物质具有足够证据证明“对人类致癌”。2A组包括“可能对人类致癌”的物质，在人类中证据有限，但在实验动物中证据充分。2B组药物“可能对人类致癌”，但在人类和实验动物中的证据有限。第3组物质由于对人类和实验动物致癌性的数据不足，“对人类致癌性不可分类”。
上述物质中，在药物中检出的物质主要为2A类，这些物质也是FDA在其指导文件《Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs》中指出的亚硝胺类。
图11 亚硝胺的致癌性分类
FDA
FDA2021年发表的《Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs》中列出了7种制药工艺中常见的亚硝胺类，并给出了其中的6种物质的限度。
图12 FDA 工业指南中列出的亚硝胺
表1 FDA 亚硝胺限度
这些限值仅适用于含有单一亚硝胺的药品。如果检测到表2中确定的一种以上的亚硝胺杂质，并且基于最大日剂量（MDD），亚硝胺杂质总量超过26.5纳克/天（最强效亚硝胺的AI），制造商应联系FDA进行评估。对于MDD小于880毫克/天的药品，建议的总亚硝胺0.03 ppm限值不超过26.5纳克/天，被认为是可以接受的。对于MDD超过880毫克/天的药品，应调整亚硝胺总量限值，以不超过建议限值26.5纳克/天。
5 亚硝胺的控制实例
沙坦类
因亚硝胺类基因毒性杂质发生召回的药品中，占比最大的是沙坦类药品，包括缬沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦等，沙坦类药物含有一个四氮唑基团，四氮唑的合成一般需要叠氮化试剂，叠氮化试剂的淬灭往往涉及亚硝酸盐以及DMF等试剂，DMF中微量的二甲胺与亚硝酸盐反应，会生成二甲基亚硝胺。
图13 沙坦类药物结构
图14 缬沙坦的合成路线
二甲双胍
最近，美国食品和药物管理局检测发现，二甲双胍产品的一些缓释产品中的NDMA水平较高，但在速释产品或原料药中没有检测到。调查正在进行中，该机构目前认为二甲双胍原料药不是产品中NDMA的主要来源。如果原料药不是二甲双胍缓释产品中NDMA的来源，那么亚硝胺污染存在的合理解释可能是使用的赋形剂或制剂的生产工艺。虽然NDMA的确认来源尚待确定，但二甲双胍原料药合成过程中的疏忽也可能是药物中NDMA的来源。二甲双胍的合成是一步反应，涉及二甲胺和二氰胺之间的反应。二甲胺是NDMA形成的前体（图14）。虽然二甲双胍中NDMA的来源尚不清楚，但据推测，微量的亚硝化剂可能与二甲胺反应形成N-亚硝胺杂质。
图15 二甲双胍中NDMA来源
雷尼替丁和尼扎替丁
雷尼替丁中NDMA有两条来源途径，一是生产过程中使用的二甲胺，二是在存储过程中的降解。湿度、温度、光和氧气均可能触发雷尼替丁的快速降解。而引发雷尼替丁降解的是一氯胺，一种重要的水消毒剂。
图16 雷尼替丁的合成和降解
尼扎替丁也有和雷尼替丁相似的降解路线。
图17 尼扎替丁的合成
利福平和利福喷丁
利福平和利福喷丁中分别含有甲基哌嗪和环戊基哌嗪基团，因此，可能产生潜在基因毒性杂质1-甲基-4-亚硝基哌嗪（MNP）和1-环戊基-4-亚硝基哌嗪（CPNP）。
FDA 2020年8月26日发文称，为了缓解或避免短缺，并帮助确保患者能够获得这些必要的药物，FDA不会反对某些制造商暂时销售含有1-甲基-4-亚硝基哌嗪（MNP）的利福平或含有1-环戊基-4-亚硝基哌嗪（CPNP）的利福喷丁，直到他们能够减少或消除杂质。利福平中MNP的可接受摄入量限值为0.16 ppm，利福喷丁中CPNP的可接受摄入量限值为0.1 ppm。FDA构不会反对某些制造商暂时销售MNP含量低于百万分之五（ppm）的利福平。该机构也不会反对某些制造商暂时销售CPNP含量低于14 ppm的利福喷丁。美国食品和药物管理局不会反对这些较高的暴露量，以维持患者获得这些救命药物的机会。
FDA 2020年10月29日再次发文称，为了继续缓解或避免短缺，并帮助确保患者能够获得利福喷丁，FDA不会反对某些制造商暂时销售含有1-环戊基-4-亚硝基哌嗪（CPNP）的药物，该药物的可接受摄入量限值高于百万分之0.1（ppm）且低于或等于20 ppm，直到他们能够减少或消除杂质。
图18 利福平和利福喷丁中亚硝胺类基因毒性杂质
畅沛（伐尼克林）[Varenicline (Chantix)]
2022年5月5日，FDA公布了对于畅沛的最新要求，要求药品中 N-亚硝基伐仑克林杂质含量应低于37ng/day的可接受限度。
图19 畅沛的结构
吡格列酮
图20 吡格列酮
EMA发布了要求生产商检测吡格列酮中亚硝胺类基因毒性杂质的公告。
图21 EMA发布的公告
6 科创承接的亚硝胺类项目
斯坦德科创在基因毒性杂质研究方面具有广泛的经验，对亚硝胺类杂质的检测已经承接上百个项目，下表中列出的为一些有代表性的项目。
生物医药是斯坦德集团的核心领域之一，业务涵盖药物研发CRO服务、药学研究、相容性研究、密封性研究、药物标准检测服务、生物制品研发测试服务、生物安全研发测试服务等领域。我们致力于为客户提供研发、分析及检测一站式服务，可有效助力企业缩短研发周期，让药品与医疗器械更快更安全的上市。
参考文献
1. FDA Guidance for Industry Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs
2. Critical Analysis of Drug Product Recalls due to Nitrosamine Impurities, J. Med. Chem. 2021, 64, 2923−2936.
3. Pathways for N-nitroso compound formation: secondary amines and beyond, Org. Process Res. Dev. Volume 24, Issue 9, 2020, Pages 1558-1585.
（公众号后台回复【亚硝胺】，获取相关文献大礼包）
干货分享 | 基因毒性杂质的法规、来源、检测、控制（第五期）
两款QSAR软件助力遗传毒性杂质研究！
斯坦德科创直播间，线上蓄能充电站！专家好课，等您来看！
左右滑动，查看更多