基于质谱技术的抗体药物二硫键表征分析
基于质谱技术的抗体药物
二硫键表征分析
二硫键是在细胞内蛋白质生物合成过程中，在两个半胱氨酸（Cys）的硫原子之间通过共价键形成的蛋白质的翻译后修饰。二硫键在蛋白质折叠过程中起着重要的作用，为蛋白质稳定性、结构-功能关系以及二硫键介导的蛋白质亚型的研究提供了重要信息。在抗体药物制造过程中，有必要对二硫键进行表征，以确认二硫键的正确连接，并验证是否存在二硫键变体，从而确保药物的安全性和有效性。此外，监管机构同样要求全面描述生物分子中的二硫键模式，以满足生物制剂的质量设计要求，因此需要有效的方法来绘制生物治疗抗体中的二硫键信息[1]。
由于生物分子的复杂性，对蛋白质中二硫键的精确表征分析仍具有一定的挑战性。相对于核磁共振波谱、X射线晶体衍射、Edman降解、对角线电泳等技术，高分辨质谱在灵敏度、准确性、操作性等多方面的优势，已成为二硫键表征分析的主流方法[2-4]。自下向上质谱分析方法是蛋白质二硫键分析中应用最广泛的方法，其优势在于各种酶的可用性，可将大的生物分子酶解成更容易分析的小肽（含有完整二硫键的肽），互补的质谱裂解技术，以及成熟的二硫键自动检索定位的质谱解析软件。使用质谱进行二硫键分析的挑战在于具有高复杂连接性的嵌套二硫键，样品制备过程中二硫键错配干扰，低水平的非天然二硫键测定等。本文主要从样品制备方法、酶解方法、二硫键分析的质谱裂解技术等角度概述基于质谱技术的抗体药物二硫键表征分析的方法。
样品制备方法概述
样品制备是自下向上质谱分析二硫键的关键步骤。一般来说，分析通常以两种方式之一进行：非还原（完整）分析或完整/还原分析。非还原法是最常用的方法，此方法需将游离Cys残基的烷基化、去糖基化（对于糖蛋白，仅在必要时），在不减少二硫键的情况下对蛋白质进行修饰，并研究二硫键连接的肽以破译蛋白质中的二硫键连接性。对于完整/还原法，制备两批酶解样品：一批二硫键完整（与前一种方法相同），另一批二硫键还原。两个样品在两次LC运行（实验）中分离，未还原样品的紫外或总离子色谱图中存在但还原样品中不存在的肽通常被认为是二硫键合的，MS/MS数据可用于解析二硫键。
样品制备过程中须防止非天然二硫键（二硫键错配）的形成，这些反应在碱性pH值和高温下非常有利，在高温下通常会发生二硫键争夺，尤其是对于含有游离巯基的蛋白质。除pH值和温度外，硫醇大小、二硫键大小以及硫醇的空间效应也会影响二硫键的形成。一般来说，用于二硫键分析的样品在室温下制备，然后在37℃下进行酶解。样品制备应在弱酸性pH条件下进行，因为在碱性pH条件下，游离硫醇脱质子，产生的硫醇阴离子或与相邻的二硫键（硫醇-二硫键交换）反应形成新的非天然二硫键。因此，在二硫键分析的样品制备过程中的第一步是封闭住任何游离的Cys残基，以防止非天然二硫键的形成。常用的Cys烷基化试剂包括碘乙酰胺（IAM）、碘乙酸（IAA）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）。NEM相比IAM和IAA反应更快，每摩尔游离Cys所需的试剂更少，在酸性pH（pH 4.3–7.0）下非常有效，而其他试剂在碱性pH（pH 8.0）下最有效。最近，Lu等人报告，当游离硫醇与IAM在pH 6.5下烷基化后进行RNase A的二硫键定位时，二硫键错配水平较低，但在相同pH下使用NEM时，未发现错配[5]。
酶解方法概述
蛋白质可以被化学或酶消化，酶消化是最广泛使用的蛋白质消化方法，酶的使用将决定蛋白质消化中二硫键结合肽的类型。
选择合适的酶有两个重要的问题：
（1）二硫键肽的大小（二硫键肽链的数目和每条肽链的长度）是多少？
（2）二硫键连接肽的二硫键连接性有多复杂？
也就是说，是否只有链间二硫键、链间和链内二硫键、嵌套链内二硫键等。如果一种酶不能产生具有简单链间二硫键的二硫键结合肽，可以使用多种酶的组合。然而，值得注意的是，使用多种酶可能会导致非常短的二硫键肽，这可能不会保留在反相柱，从而使二硫键分配困难。在这种情况下，有计划的酶解可能是必要的，这种酶解故意确保错过切割，以便获得更长的肽链。除了产生的二硫键合肽的类型外，另一个重要的考虑因素是所用酶的消化效率。此外，对具有完整二硫键的蛋白质的消化可能导致低酶解效率，因为当二硫键完整时，蛋白质的某些部分可能不会很好地暴露于酶（非还原蛋白质）。
如前所述，在二硫键分析的样品制备过程中，最重要的考虑是防止非天然二硫键的形成。因此，与烷基化反应一样，在消化过程中，pH值也是至关重要的。Sung等人[6]最近研究表明，胰蛋白酶加Glu-C或Lys-C消化在pH 6时酶解贝伐单抗未发现二硫键错配的现象，而使用Thermolysin在pH 5,6,7时进行酶解均存在一定的二硫键错配，但在更低的pH下进行酶解能减少二硫键的错配。
二硫键分析的质谱裂解技术概述
抗体药物酶解之后的肽段样品经色谱分离之后进入质谱进行分析，碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞解离（HCD）、电子转移解离（ETD）、电子捕获解离（ECD）、电子转移碰撞诱导解离（ETciD）、及电子转移高能碰撞解离（EThcD）是基于质谱的二硫键分析中常用的碎裂技术。CID/HCD是被分析离子与中性气体发生碰撞获得碎片离子信息，通常会导致肽段酰胺键断裂，同时保持二硫键完整，从而产生含有二硫键的b和y离子以及不含有二硫键的离子。ETD/ECD是电子载体与相关离子发生的碎裂反应，与二硫键结合肽的CID/HCD产生的碎片离子不同，二硫键的裂解是ETD/ECD裂解的主要反应途径，且产生c和z离子[7]。CID/HCD无法打开二硫键，含链内二硫键肽段在两个半胱氨酸之间的序列区域无法产生碎片，而ETD/ECD在这种情况下都可以产生碎片。ETD/ECD需要高电荷离子才能更加有效地捕获电子及发生裂解，在ETD的反正过程中，虽然很容易的发生电子转移，但气态离子的非共价键结合会抑制特征碎片的生成（ETnoD）。将ETD反应之后的离子进行HCD/CID的二次碎裂，可有效的打开非共价键结合离子及电荷还原态母离子，获得更多的序列碎片信息[8]。
选择合适的碎裂技术及数据采集方法对于促进质谱数据中二硫键的分配至关重要。碎裂方法的选择通常基于二硫键的复杂性、二硫键结合肽的大小，以及结合链的氨基酸序列。ETD/ECD优先用于二硫键完全环化的肽的裂解，这种肽的CID/HCD裂解通常不会显示任何骨架序列离子，而ETD/ECD 会导致二硫键和肽骨架的裂解，从而显示可用于分配二硫键的离子。对于复杂的多对二硫键的肽段，ETD/ECD和CID/HCD都不足以作为一种独立的技术来明确地定位复杂的二硫键连接性。在这种情况下，结合ETD/ECD和CID/HCD的多种碎裂模式及多级质谱功能将是破译二硫键连接性的理想方法[9]。
小结
二硫键对于维持蛋白质药物的结构和功能至关重要，因此在重组蛋白质药物生产的阶段需要准确的分析生物药的二硫键。对于抗体来说，错配的二硫键会影响蛋白的结构和功能，甚至引发抗体团聚。二硫键错配可能发生在细胞发酵或者纯化工艺的每一个阶段，因此准确的分析抗体的二硫键有助于研究人员及时发现工艺过程中的问题，及时调整工艺参数确保终产品的质量。随着数据处理软件算法的不断升级，以及新的裂解技术的出现，基于质谱技术的二硫键分析将会有更好的体验。
参考文献
[1]. Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. ICH Topic Q6B Specifications.
[2]. Characterization of IgG2 Disulfide Bonds with LC/MS/MS and Post-column Online Reduction. Anal. Chem. 2016, 88, 5080–5087.
[3]. Disulfide Bond Characterization of Endogenous IgG3 Monoclonal Antibodies Using LC-MS: An Investigation of IgG3 Disulfide-mediated Isoforms. Anal Methods. 2016, 8, 6046–6055.
[4]. Comprehensive Identification of Protein Disulfide Bonds with Pepsin/Trypsin Digestion, Orbitrap HCD and Spectrum Identification Machine. J Proteomics. 2019, 198, 78–86.
[5]. Mapping Native Disulfide Bonds at a Proteome Scale. Nat Methods. 2015, 12, 329-31.
[6]. Evaluation of Disulfide Scrambling During the Enzymatic Digestion of Bevacizumab
at Various pH Values Using Mass Spectrometry. Biochim Biophys Acta. 2016, 1864, 1188-1194.
[7]. Complete Mapping of Disulfide Linkages for Etanercept Products by Multi-enzyme Digestion Coupled with LC-MS/MS Using Multifragmentations Including CID and ETD. J Food Drug Anal. 2019, 27, 531-541.
[8] Facilitating Protein Disulfide Mapping by a Combination of Pepsin Digestion, Electron Transfer Higher Energy Dissociation (EThcD) and a Dedicated Search Algorithm SlinkS. Mol Cell Proteomics 2014, 13, 2776–2786.
[9] Direct Mass Spectrometric Characterization of Disulfide Linkages. MABS, 2018, 10, 572–582.
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