科研 | 首医大：应用TMT定量蛋白质组学发现可诊断和预测多发性硬化症的新型生物标志物（国人佳作）

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编译：微科盟-五金，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

多发性硬化症(MS)是在中枢神经系统(CNS)中由于神经元损伤引起髓鞘脱落的一种慢性自身免疫疾病，它是导致青壮年患有严重精神疾病和行动紊乱的主要原因。据统计，全世界有250万人患有多发性硬化症，其中女性多于男性。多发性硬化症具有多种表现症状，患者确诊后可根据其表现症状分为四种类型，分别为临床孤立综合型(CIS)、复发缓解型(RRMS)、原发性进展型(PPMS)和继发性进展型(SPMS)。有85-90%患者确诊为RRMS型，并随着时间的推移，这些患者中有一半发展为SPMS型。

目前，MS主要基于临床数据和影像照影等方法来诊断，其生物标志物仍未被发现。虽然血液比脑脊液(CSF)更容易获得，但由于血脑屏障(BBB)的存在，它不是研究中枢神经系统疾病中标志物的理想样品，而检测CSF中标记物可以直接反映中枢神经系统与间质液中相关疾病的病理过程。因此，CSF中标志物的检测已成为研究MS的重要手段，如检测寡克隆带(OB)、免疫球蛋白G (IgG)指数和24 h IgG的鞘内合成率等等。然而，这些传统的脑脊液标志物的敏感性和特异性较低，限制了其在疾病诊断、愈后评估和治疗效果评价等方面的应用。总之，寻找新的MS生物标志物迫在眉睫。

蛋白质组学在质谱和生物信息学的基础上蓬勃发展，质谱和生物信息学提供了一种高分辨率、高精度的策略来识别新的MS生物标志物。在本研究中，我们分析MS患者和对照组的脑脊液和血液样本成分，发现潜在的MS生物标志物。首先我们使用TMT标记结合高分辨率LC-MS/MS，分析MS患者和非炎性神经疾病(NINCs)脑脊液中存在差异的蛋白质组。然后，在另一组中使用ELISA对候选生物标志物进行验证。该研究通过蛋白质组学和质谱方法确定了MS的分子机制和病理过程，有助于发现新的MS生物标志物。

论文ID

原名：Discovery of Novel Biomarkers for Diagnosing and Predicting the Progressionof Multiple Sclerosis Using TMT-Based Quantitative Proteomics译名：应用TMT定量蛋白质组学发现可诊断和预测多发性硬化症的新型生物标志物期刊：Frontiers in ImmunologyIF：7.561发表时间：2021.08通讯作者：张国军通讯作者单位：首都医科大学附属北京天坛医院

实验设计

实验结果

1. 参与研究患者的临床数据

140例患者的临床数据见表1。MS和NINCs组中患者的年龄、性别无统计学差异(P>0.05)。同样，MS、NINCs和HC组中患者的年龄、性别也无统计学差异(P>0.05)，可从表中获得MRI T2病变系数，这些患者的数据均由神经科医师利用扩展残疾状态表(EDSS)进行记录。

表1 病人的临床数据

2. 利用蛋白质组学分析MS和NINCs患者的脑脊液组成

我们通过蛋白质组学分析，发现并确定343种蛋白质。当差异大于等于2倍或小于等于0.5倍，同时P值小于0.05时，被认为是差异表达蛋白(DEPs)。我们发现MS组与NINCs组相比有83个差异表达蛋白(DEPs)。在这些DEPs中，有37个(44.6%)蛋白表达量升高，46个(55.4%)蛋白表达量降低。根据P值和MS/NINCs丰度比将所有蛋白分布在图1A中。从DEPs表达的聚类分析中清楚地表明MS患者的各组蛋白表达与NINCs不同呈聚集分布，图1B列出83个DEPs的热点图。

图1 MS与NINCs患者的差异蛋白分布图和热点图

A图横坐标表示两组样品的Log2和t检验值，纵坐标为p-value(−Log10)，可显示两组样品间存在显著差异性。图中橙色点和蓝色点分别是显著上调和下调的蛋白质;灰色点是没有变化的蛋白质。MS(橙色)和NINCs(蓝色)患者脑脊液中DEPs聚类分析。图中每行代表一个蛋白质，每列代表一个样品。红色，高表达; 深蓝色，低表达。观察到两个主要的蛋白簇，其中一个在MS患者中下调，另一个在MS患者中上调。

3. 检测MS患者中差异表达蛋白的功能

为了更好地研究DEPs的功能，我们进行了GO分析。图2A可以看出，在P<0.05时，GO分析结果具有统计学意义。在生物学(BP)分析中氧化石墨烯显著富集在蛋白水解的负调控功能、蛋白的翻译后修饰功能、调节肽酶活性的功能和帮助血小板脱粒功能，在细胞组分(CC)分析中氧化石墨烯显著富集在含胶原的细胞外基质、内质网腔和胞浆囊腔中。在分子功能(MF)分析中氧化石墨烯富集在细胞外基质、糖胺聚糖结合域和肽酶调节活性域中。此外，我们对DEPs进行KEGG通路分析，富集最显著的通路如图2B所示，主要涉及PI3K-Akt信号通路、补体系统、Ras信号通路和MAPK信号通路。

图2 MS相关蛋白的GO值和KEGG通路分析

基于生物过程、分子功能、细胞成分和KEGG通路对83种DEPs分类。A图中横坐标表示每种功能中DEP的数量，纵坐标为各种DEP蛋白。B图中纵坐标为显著富集KEGG通路，横坐标为KEGG通路富集基因数/总基因数, 图中的颜色表示p值的大小, 点的大小表示基因数。

4. 分析各DEPs蛋白的相互关联

利用STRING PPI数据库和Cytoscape工具，我们建立了PPI网络，发现有60个DEP蛋白表现出相互作用，如图3所示。图中斑点为DEP蛋白，绿色为下调蛋白，橙色为上调蛋白。使用Cytoscape工具调节斑点的大小，在网络中，与蛋白质A直接相互作用的蛋白质数量称为蛋白质A的连接度。一般来说，蛋白质的连接度越大，当蛋白质发生变化时，对整个系统的干扰就越大。这种蛋白质是维持系统平衡和稳定的关键。我们使用Cytoscape工具设置斑点的大小，以反映斑点的连接度。较大的斑点表示该斑点的连接度较多。利用该网络分析连接度后，排名前10的蛋白质包括：KNG1, C4A, IGFBP7, PENK, CSF1, IGF2, TGOLN2,IGFBP4, GOLM1, SST。在前10位的蛋白中，IGF2、IGBP7和SST变化较大(FC分别为4.43、2.60和0.17)。此外，我们在前期研究中发现IGF2、IGFBP7、SST与髓鞘脱离疾病有关。因此，我们选取IGFBP7、IGF2和SST这3种蛋白进行后续实验。

图3 PPI网络

通过PPIs，基于“证据”模式和中等水平的置信度预测83个DEP蛋白中有60个直接相互作用。节点代表蛋白质，线代表PPIs。连接度决定节点的大小，其中橙色表示上调，蓝色表示下调。

5. ELISA方法验证DEPs各蛋白的表达量

对不同组中的脑脊液和血清样本进行ELISA测定，检测DEPs的表达量。MS组与NINCs组相比，脑脊液中IGFBP7显著上调，SST显著下调(图4A, B)。这一结果与我们蛋白质组学分析结果一致。但IGF2蛋白表达水平没有明显变化，这与我们前期结果不一致(图4C)。同时对这三种DEP蛋白在血清水平进行验证，有趣的是，与对照组相比，MS患者中只有血清中IGFBP7水平升高，这与CSF结果一致(图4A)。另外两种蛋白在MS患者的血清中没有明显变化(图4B, C)。

图4 分析MS和对照组的血清和脑脊液样品中IGFBP7、SST和IGF2的含量

A图为MS患者和对照组的血清和脑脊液中IGFBP7含量。B图为MS患者和对照组的血清和脑脊液中的SST含量。C图为MS患者和对照组的血清和脑脊液中IGF2的含量。图中只显示显著差异组。有统计学意义的定义为***P<0.001。

6. 分析SST和IGFBP7对MS表型的影响

 根据2013年最新更新的关于MS分类中，复发缓解型(RRMS)和继发性进展型(SPMS)被作为MS的两大主要表型，在我们的验证中，23例患者被诊断为RRMS, 17例患者被诊断为SPMS。对比RRMS和SPMS患者，SPMS患者血清和脑脊液中IGFBP7水平均明显高于RRMS患者（P=0.011，P=0.026；图5A）。然而，SPMS和RRMS患者血清和脑脊液SST水平差异无统计学意义(P=0.914, P=0.477；图5 B)。

图5 检测IGFBP7和SST含量

图A 表示RRMS和SPMS患者血清和脑脊液中IGFBP7含量。图B表示RRMS和SPMS患者血清和脑脊液中的SST含量。图中只显示显著差异组。有统计学意义的数据定义为 *P<0.05。

7. 检测IGFBP7在血清和脑脊液含量变化

 在MS患者的血清和脑脊液中检测IGFBP7含量。从图6A可以看出，脑脊液中IGFBP7的中位浓度为16.395 (11.848-24.072) ng/mL，显著高于血清中IGFBP7的中位浓度(4.333 ng/mL, 2.351-6.933 ng/mL;P = 0.002)。有趣的是，MS患者血清中IGFBP7水平与脑脊液中IGFBP7水平呈正相关(R=0.454, P=0.003，图6B)。

图6 比较MS患者血清与脑脊液中IGFBP7含量

图A表示40例患者的脑脊液和血清样品中IGFBP7含量。图B表示MS患者脑脊液与血清中IFGBP7的相互关系(n=40)。有统计学意义的定义为***P<0.001。

8. 通过SST和IGFBP7诊断MS类型

 受试者特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)分析得到的曲面面积(area under The curve, AUC)表明SST和IGFBP7对MS患者的诊断效果。如表2所示，脑脊液中SST、IGFBP7和血清中IGFBP7的水平可用以区分MS和NINCs(图7A)。ROC曲线分析中最常用的截断点是约登指数的最大值。约登指数被定义为(敏感性+特异性-1)的最大值，直接衡量一个生物标志物能够达到的最大准确性。脑脊液 IGFBP7的临界值为13.8 ng/mL，敏感性为90%，特异性为87.5%，血清IGFBP7的临界值为3.7 ng/mL，敏感性为80%，特异性为67.5%(表3)。脑脊液SST的临界值为2.0 ng/mL，敏感性为97.5%，特异性为92.5%(表3)。这表明脑脊液IGFBP7、血清IGFBP7和脑脊液SST可能成为MS的生物标志物。此外，我们研究了这些生物标志物预测SPMS的能力。从表2和图7B可以看出，血清和脑脊液IGFBP7对SPMS均具有显著的预测价值。值得关注的是，血清IGFBP7在区分SPMS和RRMS方面的准确性高于CSF IGFBP7。血清IGFBP7的临界值为4.3 ng/mL，敏感性为76.5%，特异性为69.6%，CSF IGFBP7的临界值为17.2ng/mL，敏感性为58.8%，特异性为78.3%(表3)。这些结果表明血清和CSF IGFBP7均可用于预测MS。

图7 IGFBP7和SST在MS的诊断价值

图A ROC曲线诊断MS。图B ROC曲线区分SPMS和RRMS类型

表2 MS中SST和IGFBP7含量

表3 生物标志物特征

讨论

以前，由于多发性硬化症的临床症状和病理学比较复杂，很难发现可靠的生物标志物。尽管大约有10-15 %的MS患者从开始发病都要经历一个渐进过程MS (PPMS)，即疾病从RRMS的初始阶段发展到SPMS的后续阶段。从RRMS到SPMS表型的转变是一个渐进过程，因此，临床医生对SPMS的诊断通常被延误，导致患者明显地持续性行动不便。据研究表明，从RRMS到SPMS的平均诊断周期是2.9年。因此，迫切需要生物标志物来诊断RRMS，并监测疾病的进展程度以确诊SPMS。

我们使用TMT的定量蛋白质组学技术分析MS和NINCs患者的脑脊液，以确定潜在的可用于诊断MS的生物标志物。在2倍比例处截取，我们发现MS患者中有37个蛋白的表达量比NINCs多，46个蛋白的表达比NINCs少。利用生物信息学对这些蛋白进行分析，发现这些DEPs可能在MS发病机制中发挥重要作用。我们最终选择了IGFBP7、IGF2和SST三个候选生物标志物进行后续实验。我们验证了这三个候选蛋白，最终证明IGFBP7和SST这两个蛋白在MS患者的脑脊液中受到显著调控，这与我们在之前通过蛋白质组学得到的结果一致(图4)。令人惊讶的是，在MS患者中可重复观察到血清IGFBP7水平的提高。此外，CSF中IGFBP7较相应血清中含量显著升高(图6A)。随后，我们发现血清IGFBP7水平与CSF IGFBP7水平呈正相关(R=0.454)(图6B)。

接下来，我们研究了CSF和血清中候选蛋白在MS诊断和预测疾病进展中的作用。诊断MS时，CSF SST的ROC曲线下面积(AUC)为0.986(0.966-1.000)，高于CSF IGFBP7[0.931(0.871-0.992)]和血清IGFBP7[0.770(0.664-0.876)](图7A和表2)。因此，CSF中 SST和IGFBP7对MS表现出较好的诊断能力。在区分SPMS和RRMS表型方面，血清IGFBP7的AUC(0.747)高于CSF IGFBP7 (AUC:0.707)(图7B)，说明在临床应用中，血清IGFBP7可能比CSF IGFBP7更适合作为MS表型的标记。总的来说，这些结果突出了IGFBP7在MS诊断和区分中具有的巨大潜力。

在以往研究中发现IGFBP存在于中枢神经系统脉络膜中，其中IGFBP7通过星形胶质细胞，少突胶质细胞和神经元分泌。IGFBP7是一种约30 kDa的细胞粘附糖蛋白，是IGFBP超家族的成员，通过IDG依赖或非依赖机制调节细胞功能。IGFBP7又称IGFBP7相关蛋白1 (IGFBP-rP1)或称肿瘤衍生黏附因子/血管调节蛋白。在以前研究中，IGFBP7含量会在在中枢神经系统的病理条件下，如胶质母细胞瘤和中风，以及EAE中都发现升高。研究中，我们发现IGFBP7在MS患者的脑脊液和血清中均上调。此外，血清IGFBP7与CSF IGFBP7呈正相关(图6)，这表明可以用IGFBP7代替血清检测来减少患者创伤。研究结果与之前研究结果一致，表明IGFBP7表达量可能与炎性脱髓鞘程度相关。SPMS患者中IGFBP7的水平明显高于RRMS患者，这可能是由于随着疾病发展导致炎症反应增加，IGFBP7的表达增加。IGFBP7在MS发病机制中的作用尚不清楚，根据GO分析IGFBP7在MS中的作用，我们猜测可能的发病机制涉及翻译后蛋白修饰。但具体的发病机制还需要在后续的研究中进一步验证。

有报道称IGF2基因在非活性脱髓鞘病变中表达量增加。在我们的研究中也发现IGF2蛋白含量升高。因此，我们采用ELISA方法进行了验证。然而，我们得到了不一致的结果，在CSF或血清样本中，MS组和对照组之间的IGF2蛋白水平没有显著差异，但本研究的结果还需要进一步的验证。

生长抑制素(SST)是一种生长激素抑制肽，被发现在许多中枢神经系统疾病中发挥重要作用，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和脱髓鞘疾病。近年来，人们开展了许多关于SST在中枢神经系统疾病中作用的研究。据报道，脑脊液中SST的下降导致多发性硬化症患者的认知功能下降。MS患者复发时CSF中SST含量很低，这被认为是由于SST分泌细胞的减少或不分泌所致。我们发现MS与NC患者相比脑脊液中SST含量较低。然而，在血清样品中没有得到类似的结果。

我们的研究也存在局限性，仅筛查MS患者的CSF进行蛋白质组学分析，未对相应的血清样本进行蛋白质组学分析，IGFBP7和SST含量是否受病情影响尚不清晰。另一个局限性是我们的研究患者中没有癌症和心脏病患者，而在这些患者中IGFBP7的表达也会发生改变，这在临床应用中应予以考虑。此外，IGFBP7是否与其他两种MS类型 (PPMS和CIS)相关还需要进一步研究。目前只是对MS中差异表达蛋白的初步研究，仍需要进行验证以阐明MS的潜在机制。

结论

总之，我们提供了一种基于TMT的蛋白质组学和LC-MS/MS联用的方法，来筛选鉴定相关蛋白的方法。我们研究结果表明，SST和IGFBP7在诊断和预测MS的表型方面具有重要价值，为后续研究SST和IGFBP7在MS发病机制中的作用提供了理论依据。

原文链接：  

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8417809/

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