科研 |J. Allergy Clin. Immunol.:改变的白细胞亚群和免疫蛋白质组表明肥大细胞增多症的促炎机制
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导读静止性全身性肥大细胞增多症(ISM)的特点是肥大细胞的病理堆积。其表型异质性背后的机制尚不清楚。肥大细胞与其他免疫细胞的相互作用可能引起全身炎症，从而引起相关症状。为了研究ISM中的外周白细胞区室和血清免疫蛋白质组，本研究在18名患有ISM的成年人和12名健康对照者队列中使用流式细胞术进行外周血白细胞表型分析，采用靶向蛋白质组学测量另外20名 ISM患者和20名健康对照者血清中与炎症相关的169种蛋白质。结果发现，ISM患者外周血中浆细胞样树突状细胞(pDC)和单核细胞的比例显著降低，而T辅助细胞2细胞增加。此外，本文观察到从幼稚T细胞到记忆T细胞的转变。血清蛋白质组的分层聚类揭示了ISM患者中两个不同的亚组。在A亚组(n=8)中，62种蛋白质显著过表达，而B亚组(n=12)与健康对照组相当。A亚组患者toll样受体4、TNF-α和干扰素-γ疲劳下游信号通路上调较B亚组更多。随后的两组ISM患者中观察到白细胞亚群和促炎蛋白质组的分布改变。本研究由这些结果推测肿瘤肥大细胞募集并激活pDC、单核细胞和T 细胞，从而导致炎症恶性循环。ISM中炎症机制的表征可能会发现如疲劳等其他治疗靶点。
论文ID
原名：Alteredleukocyte subsets and immune proteome indicate pro-inflammatory mechanisms in mastocytosis译名：改变的白细胞亚群和免疫蛋白质组表明肥大细胞增多症的促炎机制期刊：Journal of Allergy and Clinical ImmunologyIF：10.793
发表时间：2022.01通讯作者：M.A.W. Hermans,MD通讯作者单位：伊拉斯姆斯大学医学中心
实验设计
实验结果
1. 病人特性
队列I用于外周血白细胞亚群的流式细胞免疫表型，由18名ISM患者和12名健康对照者组成(表1)。ISM患者的中位年龄为52岁(范围31-83)，其中12名（67%）为女性，纳入时血清中位胰蛋白酶为29 g/L(范围10.9-134)。15例患者皮肤受累，表现为斑丘疹性皮肤肥大细胞增多症(83%)。
表1 初始队列与第二队列的基线特征比较
IQR：四分位距；MPCM：斑丘疹性皮肤肥大细胞增多症。特应性：存在特应性皮炎、过敏性鼻结膜炎、哮喘或特异性IgE对抗吸入性过敏原。T分数通过骨密度测定法测量。*连续变量的Mann Whitney U检验和二分法变量的Fisher精确检验。** KIT D816V突变状态在其他患者中未知。
队列II用于血清蛋白质组学分析，包括20名ISM患者和20名年龄和性别匹配的健康对照者。ISM患者的中位年龄为48岁（范围21 - 63），14名（70%）患者为女性，纳入时血清类胰蛋白酶的中位值为21.5 µg/L（范围4.4- 97）。14名患者(70%)患有斑丘疹性皮肤肥大细胞增多症。两个队列的患者在人口统计学特征和肥大细胞增多症相关症状方面总体上具有可比性（表1）。表E4总结了每位患者的个体特征。
图1 ISM的外周血白细胞亚群(队列I)
与健康对照组相比，ISM患者外周血中白细胞亚群的流式细胞术分析显示，在肥大细胞增多症中，浆细胞样树突状细胞比例降低，单核细胞比例降低。*p<0.05；***p<0.001。
2. 白细胞亚群
在队列I（n = 18名患有ISM的成年人）中，总淋巴细胞、总粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例与健康对照组相当（图1）。然而，ISM患者的单核细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)的比例显著降低（分别为p<0.05和p <0.001）。虽然ISM和对照组的T细胞、B细胞和NK细胞总数相当，但ISM患者的Th2细胞数量显著增加（p <0.05），导致Th1/Th2比率降低，表明Th2偏斜（图2B)。Th17细胞、调节性T细胞和滤泡性Th细胞的比例在患者和对照组之间没有差异。与健康对照组相比，ISM与CD8+中枢记忆T细胞数量增加（p <0.01）和CD8+幼稚T细胞相对减少有关（p>0.05，图2C）。尽管我们在CD4+T 细胞中观察到类似的记忆表型偏斜，但没有达到统计学意义（图2D）。
表2 蛋白质组学队列II (N=20)的基线特征，按蛋白质表达模式分组
IQR：四分位距；MPCM：斑丘疹性皮肤肥大细胞增多症。特应性：存在特应性皮炎、过敏性鼻结膜炎、哮喘或特异性IgE对抗吸入性过敏原。T分数通过骨密度测定法测量。*连续变量的Mann Whitney U检验和二分法变量的Fisher精确检验。** KIT D816V突变状态在2个患者中未知。
图2 ISM患者外周血T细胞亚群(队列I)
A) T 细胞亚群的门控策略。B)血液中Th2细胞的总数增加。结果，ISM患者的Th1/Th2比值降低。C)观察到CD8+ T细胞从幼稚向中枢记忆表型倾斜。D) CD4+ T细胞也出现类似趋势，但未达到统计学意义。T细胞上的CD45RA表达与对照组没有不同。* p<0.05；**p<0.01。
pDC比例与Th1/Th2比例及胰蛋白酶水平无相关性。此外，pDC的比例与CD8幼稚或记忆亚群的数量无关。最后，有或没有斑丘疹性皮肤肥大细胞增多症、瘙痒、过敏反应或疲劳的患者的pDC百分比没有差异。
3. 在ISM患者亚组中有一个独特的血清蛋白质组谱
我们在队列II中进行了血清蛋白质组研究，其中包括20名ISM患者。首先，我们使用所有169种研究蛋白质的NPX值进行主成分分析(PCA)（图3）。在PCA图中，11例ISM患者位于健康对照组附近，而其他9例患者明显不同于对照组，其中8例聚集在一起，1例单独的离群值。
图3 20名ISM患者与20名健康对照的主成分分析（队列II）
ISM患者的免疫蛋白质组是异质性的，可以识别出2个亚组。A亚组的8例患者均与B亚组的其他患者(n=12)和对照组分开。这种划分与层次聚类所识别的亚组相同（图4）。亚组A的受试者编号在PCA图中显示，以便与图4进行比较。
随后我们对ISM和健康对照样本的169个研究蛋白进行非监督层次聚类，也发现ISM受试者之间存在异质性(图4A)，区分出PCA图中相同的两个ISM亚组。与亚组B (n = 12)相比，亚组A (n = 8)显示促炎蛋白普遍上调，这与PCA图中可见的健康对照组没有差异(图3)。实际上，ISM亚组B和健康对照之间没有任何测量的蛋白质有显著差异。因此，我们继续对A亚组进行进一步分析。ISM亚组A与健康对照组的比较显示，62种蛋白质在该ISM亚组中的表达明显更高（图4B和图E2）。虽然没有统计学意义，但与亚组2相比，ISM亚组A的疲劳发生率有更高的趋势（分别为75%和33%，p=0.06）。两个亚组在其他肥大细胞增多症相关症状和特应性方面没有差异（表2）。
表3 在蛋白质组学队列II的亚组A中有大量显著上调的蛋白
4. ISM亚组A TLR4信号转导和IL-6家族细胞因子上调
ISM 亚组A血清中62种目标蛋白质的独创性途径分析揭示了这些蛋白质上游涉及的三个主要途径（表E5）。这特别涉及Toll样受体4 (TLR4)通路的激活，涉及28/62个蛋白质（z-score 4.192）。此外，20/62蛋白质被鉴定为TNF-α的下游（z-score 4.043），18/62蛋白质在干扰素-γ的下游（IFN-γ；z-score 3.835）。
接下来，我们对62种重要蛋白质进行层次聚类，以识别蛋白质簇的共聚集（图E3）。这揭示了五个共同调节的蛋白质簇。我们使用Ingenuity和其他文献研究对这些簇进行了功能分析（表3）。根据Ingenuity通路分析，簇1中的蛋白质与T细胞、树突细胞和肥大细胞的激活有关，而其他4簇中的蛋白质主要与细胞增殖、细胞存活和凋亡有关。然而，簇2到5还包含几种参与I/II型干扰素、TNF-α或IL-18信号级联的蛋白质。此外，A亚组的IL-6和制瘤素-M增加（尽管分配到不同簇）。这两种细胞因子都属于同一个细胞因子家族（白细胞介素6家族），之前已在肥大细胞增多症中证实血清水平升高。
图4 通过蛋白质组学测量的所有炎症相关蛋白的分层聚类（队列II）
A) 对所有169个分析的独特蛋白质进行非监督分层聚类显示肥大细胞增多症队列中有两个不同的亚组。与对照组相比，A亚组具有明显不同的表达谱，而B亚组(n = 12)中0个蛋白与对照有显著差异，这可以从来自B亚组的患者在对照之间混合的聚类图中观察到。B)与健康对照组(n=20)相比，A亚组(n=8)有62个蛋白显著过表达。比例尺：红色，与几何平均值相比表达增加；蓝色，与几何平均值相比表达减少。颜色强度表示变化的程度。
讨论
这项探索性研究在至少一部分ISM患者中发现了广泛免疫激活的迹象。首先，与健康对照组（队列I）相比，在18名ISM患者的外周血中观察到pDC和单核细胞比例降低，Th2细胞增加。第二组20例ISM患者随后显示免疫蛋白质组有相当大的异质性，可区分为两个亚组。队列II中的8例ISM患者显示了以T细胞、DC、单核/巨噬细胞激活和IL-6、TNF-α和I/II型干扰素为特征的促炎血清蛋白特征。因此，这两个队列的研究结果相互补充，表明系统性肥大细胞增多症的免疫激活超出了肥大细胞本身，涉及其他几种细胞元素。
肥大细胞可以通过各种途径影响免疫系统，主要是由于它们驻留在结缔组织中，在那里它们可以与邻近的细胞交流。ISM患者外周血中发现的pDC和单核细胞数量减少可能反映了对受影响组织（如皮肤、骨髓和淋巴系统）的募集增加，这是由那里的肿瘤性肥大细胞驱动导致的。单核细胞进入组织后，会发生剧烈的表型变化，并演化为巨噬细胞，而巨噬细胞是TNF-α和IFN-γ的主要生产者。肥大细胞和单核细胞/巨噬细胞之间的相互作用仍有很多未知的地方。然而，肥大细胞株HMC1产生高水平的单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)，这是单核细胞的一种重要的趋化因子。因此，体外活化的肥大细胞会募集单核细胞，并随后刺激它们产生TNF-α。队列II的A亚组MCP-1水平升高(与健康对照组相比，变化倍数为1.29)，但未达到统计学意义。这两个ISM队列的结果表明单核细胞激活和潜在的向组织迁移。其他重要的单核细胞趋化因子如CCL5未包括在我们研究中使用的蛋白质组中。与对照组相比，ISM患者外周血中浆细胞样DC也较少。pDC 能够产生高水平的I型干扰素，以及IL-6和TNF-α，它们在队列II的A亚组中均上调。A亚组pDC的重要趋化因子CCL19的平均水平也显著升高。CCL19通常在淋巴组织中表达，但也存在于炎症皮肤中，其水平与DC/T细胞簇的存在相关。此外，pDC和CD8+DC在淋巴组织的选择性内流是肥大细胞依赖的，组胺和IL-6是不可或缺的介质。此外，pDC和CD8+DC在淋巴组织的选择性内流是肥大细胞依赖的，组胺和IL-6是不可或缺的介质。
图5 肿瘤性肥大细胞诱导的一般炎症的假设模型
对于这张图，我们以皮肤为例，但类似的机制可能发生在其他器官，如淋巴器官、骨髓或肠道。肿瘤肥大细胞 (MC) 产生的蛋白酶会影响皮肤环境并激活角质形成细胞以产生CCL19，从而从循环中募集浆细胞样树突状细胞(pDC)和幼稚T细胞。MC还产生高水平的MCP-1，吸引单核细胞进入皮肤。随后，MC可以通过产生可溶性介质(最重要的是IL-6，TNF-α，组胺)，通过剪切IL-18和IL-33的早期形式，以及通过细胞间直接接触，刺激pDC，单核细胞和T细胞的激活。此外，MC通过pDC诱导Th2极化，也可能直接通过IL-4的产生诱导Th2极化。结果，促炎信号的恶性循环出现在所有四种参与细胞类型之间。这导致循环pDC和单核细胞数量减少，Th室向Th2倾斜，以及促炎血清蛋白组。与上述类似的过程可能发生在肿瘤性MC的其他“庇护所”，例如骨髓。
队列I中从幼稚T细胞向中枢记忆T细胞的倾斜以及在队列II的A亚组中观察到的血清CD5、CD6 和CD40水平升高，表明至少一部分ISM患者的T细胞活化。此外，活化的肥大细胞上清使DC倾向于促进Th2类型，这与我们观察到的Th2细胞数量增加相符。肥大细胞也可以通过细胞相互作用和可溶性介质（最重要的是IL-6和TNF-α）直接激活T细胞。此外，T细胞衍生的IFN-γ增加肥大细胞诱导的T细胞刺激并抑制肥大细胞的凋亡。在蛋白质组学队列的A亚组中，各种IFN-γ相关蛋白上调(表E5)。总的来说，这些数据表明ISM中pDC、单核细胞和T细胞的激活，可能导致至少在一部分ISM患者中由来自肿瘤肥大细胞的促炎信号诱导的自我强化激活循环（图5）。据我们所知，尚未有人研究肥大细胞增多症患者皮损皮肤中单核细胞/巨噬细胞、pDC或T细胞的浸润。
如前所述，我们可以根据队列II中的血清蛋白质组区分两个明确的亚组。A亚组具有促炎蛋白特征，其特征在于TLR4、IFN-γ和TNF-α相关通路的上调。62种显著上调的蛋白质的分层聚类揭示了许多其他参与细胞增殖和存活的蛋白质。IL-6和制瘤素-M的水平也增加了。这两种促炎细胞因子都是由携带KIT D816V突变的肿瘤肥大细胞产生的。血清细胞因子水平升高与全身肥大细胞增多症中出现疲劳和全身症状有关，但与肥大细胞介质相关症状无关。这与我们的发现类似。因此，炎症信号通路似乎有助于全身症状，但较少涉及经典症状，例如瘙痒和过敏反应。目前尚不清楚这些炎症过程发生在何处。可以很明显推测皮肤是pDC、巨噬细胞和T细胞与肥大细胞相互作用的主要部位。然而，ISM亚组A中并非所有患者皮肤受累。因此，骨髓和淋巴组织中的肿瘤肥大细胞可能也参与了局部和全身炎症的驱动。
在队列II中62个显著上调的蛋白中，除了促炎蛋白外，还有几种与肥大细胞脱粒相关的物质。Gulen等人最近发表了19名肥大细胞增多症患者的血清蛋白质组学数据，重点研究了过敏反应而非炎症。他们发现，尽管与对照组相比，肥大细胞增多症患者的Allergin-1和 pappalysin-1平均水平升高，但过敏反应患者的这两种物质的水平显著降低。在我们的队列II中，Allergin-1在12/20肥大细胞增多症受试者中上调（与对照组相比，p = 0.001）。然而，我们发现Allergin-1水平与过敏反应之间没有显著相关性。Gulen等人与我们结果相互矛盾。这再次证明ISM的异质性以及需要更大的队列来确认结果。
外周血中炎症活性衍生物的测量有几个注意事项。首先，一些蛋白质被快速代谢或与蛋白质结合，这可能会妨碍检测。其次，肥大细胞存在于结缔组织和粘膜中，因此，与血液相比，肥大细胞的介质在受影响组织中的含量可能更高。这也解释了外周血白细胞，其中减少可能表明募集到另一个组织区室。在全身性肥大细胞增多症中，肿瘤性肥大细胞主要存在于骨髓和皮肤中，它们可能会改变局部环境，吸引和激活其他白细胞。关于肥大细胞增多症中成对血液和组织样本的研究尚未发表。我们研究的另一个限制是相对较小的患者队列。虽然这是罕见疾病所固有的，但我们需要谨慎推断结果，并需要进一步的研究。最后，在不同的队列中进行了细胞和蛋白质组分析。然而，两个队列的临床特征具有可比性。此外，观察到的外周血白细胞亚群的改变在病理生理学意义上与血清蛋白质组相匹配，这也可以认为是本研究的一个优势。
结论
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