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科研 |Science子刊：单细胞空间蛋白质组学成像新进展（国人佳作）
编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读由于现阶段分子生物学及质谱技术的通量和灵敏度有限，使得单个细胞的原位空间蛋白质组学分析还无法成功完成。随着免疫核酸扩增技术不断进步，最新进展似乎为解决多重单细胞空间蛋白质组学这一难题提供了机会。本文报告了一种创新的杂交链式反应(HCR)技术，该技术涉及计算机辅助设计(CAD)和可逆组装。CAD实现了高度复用的HCR序列数据库并行工作，而可逆组装实现了HCR在工作状态和静止状态之间的切换。因此，CAD-HCR已成功用于单细胞空间蛋白质组学分析。CAD-HCR的荧光信号与常规免疫荧光相当，与靶蛋白的丰度呈正相关，有利于蛋白的可视化。本研究开发的方法扩展了单细胞分析和蛋白质组学研究的工具箱，提升了HCR的性能和应用范围。
论文ID
原名：Computer-aided design of reversible hybridization chain reaction (CAD-HCR)enables multiplexed single-cell spatial proteomics imaging译名：计算机辅助设计可逆杂交链反应(CAD-HCR)使多重单细胞空间蛋白质组学成像成为可能期刊：Science AdvanceIF：14.136发表时间：2022.01通讯作者：谭蔚泓、朱小立、杨宇、孙奋勇通讯作者单位：上海交通大学医学院、中国科学院大学附属肿瘤医院、湖南大学化学化工学院、同济大学医学院、上海大学生命科学学院
实验设计
实验结果
在典型的HCR中，我们采用了两个发夹寡核苷酸。单链DNA起始子（缩写为“I”）可以打开其中一个发夹，从而暴露一个以前无法识别的单链区域，该区域可以打开另一个发夹（图1A）。反应循环进行，导致形成有缺口的双链串联体。以前的报告表明可以组装成百上千个发夹组成部分。为了将HCR与DNA交换技术相结合，这里开发了一种可逆的HCR。采用了两种策略，称为间隙HCR(gHCR)和尾部HCR (tHCR)（图1B）。对于gHCR，我们在第一个发夹的环中插入一个额外的单链区域；对于tHCR，额外的单链区域放置在发夹的3’端。在起始子启动后，两个发夹（即H1和H2）可以分别组装成双链串联体，在gHCR和tHCR的情况下具有重复的间隙或尾部（图1C）。为了分解串联体，额外的区域（即间隙和尾部区域）用作结合寡核苷酸清洗剂（缩写为“W”）的立足点，反过来，它可以与H2竞争，通过链置换与H1杂交。因此，串联体分解，使得起始子与大量由H1/H2/W组成的三元片段分离。
(A) 常规HCR示意图。(B) gHCR和tHCR组成部分的详细信息。(C) gHCR和tHCR的组装和分解。(D) 多重gHCR和tHCR的CAD概述。(E) tHCR在空间蛋白质组学成像分析中的应用工作流程。
接下来，我们根据自定义规则并使用CAD创建一个由H1、H2、I和W组成的数据库（图1D）。相关四个寡核苷酸的四个独立区域，即H2的环（区域1）、H1和H2的主干（区域 2）、tH1的环（区域3）和W的互补立足点（区域4），被创建。HCR的基本设计原则和1、2、3区的划分参考了传统的HCR，而用于串联体分解的区域4是自定义的。根据已有的关于HCR和链置换的报告，我们制定规则如下：1) 长度：区域2和区域1、3和4的长度分别设置为16和7 nt。2）碱基组成：区域2和区域1、3、4的G/C含量分别固定为50%（G/C = 8 nt, A/T =8 nt）和43%（G/C = 3 nt，A/T = 4 nt)，在复用HCR之间获得相同的热稳定性。3）序列相似性：区域2和区域1、3、4的数据库中任意两条相同序列的长度分别不超过6和4nt，保证不同组的HCR可以同时运行，互不干扰。此处，区域长度固定为现有报告中使用的中等长度，G/C的含量固定为约50%（常用40%至60%）。至于序列相似度，是自行设计的，可以进行调制。总体指导原则如下：（i）最终数据库的容量足以进行多重成像（至少几十个），并且（ii）不同基团HCR之间的交叉反应基本消除。在上述规则的基础上，使用Perl脚本（具体代码附在补充材料中，并已存放在Zenodo上），我们创建了区域2和区域1、3和4的序列数据库，其中为区域2分配了174个序列（表S2），为区域1、3和4分配了208个序列（表S3）。因此，通过随机选择数据库中的序列组成H1、H2、I和W，我们可以建立gHCR和tHCR。理论上，序列数据库可以支持103个gHCRs或tHCRs在1、3、4区208个序列中同时工作。区域1和3每个从208去除2个，留给统一的区域4。请注意，序列数据库的容量可以根据需要通过修改设计规则来扩大或缩小。例如，增加序列相似性可以扩展序列数据库，但在序列相似性高的情况下，多重的HCR之间可能会发生交叉反应。因此，我们应考虑相似性和交叉反应之间的平衡。
(A和B) 10组(A)tHCR和(B) gHCR组装和分解的琼脂糖凝胶分析。(C和D) 两组(C) tHCR和(D) gHCR正交性的琼脂糖凝胶分析。(E) tHCR和gHCR产品（各一组）在组装前、组装后和分解后的原子力显微镜(AFM)图像。(F) 由不同起始子启动的tHCR和gHCR (各一组)产物的AFM图像。(G) tHCR和gHCR两组组装和分解的动态荧光分析。数据代表三次实验的平均值±SD（误差线）。比例尺，500 nm。
通过与免疫识别结合，可逆的多重gHCR或tHCR有望用于空间蛋白质组学分析。具体的工作流程如图1E所示。具体来说，可以正交启动多重gHCR或tHCR的起始子被标记在特定的一抗（缩写为“PA”）上。所有“3n”起始子条形码的一抗同时应用于细胞，以使用正交起始子对靶蛋白（缩写为“P”）进行编码。然后，细胞准备好进行成像循环。在第一个成像周期中，三个标记在靶点结合的一抗上的3n起始子正交启动三个独立的、分别标记红色、绿色和黄色荧光团gHCRs或tHCRs。因此实现了三种蛋白质的原位放大成像分析。然后，我们准备使用另外三个与相应靶蛋白正交的gHCR或tHCR进行第二次成像循环，以避免残留非正交起始子的干扰。在“n”个循环之后，3 × n蛋白质可以通过3 × n组gHCR或tHCR进行成像。最后，通过计算机对这些经过多次循环生成的图像进行重新着色和对齐，可以获得单个细胞内大量蛋白质亚细胞定位的综合图像。
2. 体外可逆HCR的表征
通过从序列数据库中随机选择10组H1、H2、I和W，我们分别建立10组gHCR和tHCR（表S1）作为模型。我们采用琼脂糖凝胶电泳研究gHCR和tHCR的组装和分解。在tHCR的情况下，图2A显示相应的tH1和tH2在正交起始子（每组的第二道）存在下形成双链扩增的串联体，而在没有起始子的情况下可以观察到tH1和tH2单体的清晰条带（每组的第一道）。在组装好的tH1和tH2中添加washer进一步导致串联体分解并形成由tH1/tH2/tW组成的三元片段（每组的第三条道），表现为分子量大于单体的清晰条带。在gHCR的情况下也获得了类似的结果，这表明它们都可以在体外按预期工作（图2B）。图2（C和D）和图S1表明只有正交的起始子可以启动相应的HCR，而其他起始子完全无效。请注意，H1和H2在电泳中无法区分，因为它们具有相似的长度和组成，而对于I，其条带缺失，因为长度较短、浓度较低和单链结构使其难以染色和可视化。此外，我们通过核酸包 (NUPACK) 验证了起始子和发夹之间所需区域和不需要区域的热稳定性（图 S2）。结果表明，所有所需域的自由能约为-29 kcal/mol，而所有非所需域的自由能在-12和0 kcal/mol之间变化。自由能的显著差异被认为是限制交叉反应的主要因素，应归因于合理的设计规则。该结果为多重HCR的并行工作奠定了基础，该工作应受益于CAD和避免由序列相似性引起的相互干扰。tHCR和gHCR的可逆和正交组装也通过使用原子力显微镜(AFM)得到证实，允许将扩增的串联体和分解片段的产物清楚地观察为分别具有典型双链高度和点状分布的长线性链（图2，E和F，以及图S3和S4）。我们通过分别用猝灭剂（H1区域1'的3'末端的黑洞猝灭剂1(BHQ1)和荧光团（在H2区域2'的3'末端的羧基荧光素(FAM)标记t1H1、g1H1、t3H1、g3H1、t1H2/g1H2和t3H2/g3H2，进一步研究了tHCR和gHCR可逆组装的动力学。图2G显示了在添加起始子后进行组装。发生这种情况时，H1和H2的接近迫使测量的荧光随着时间的推移逐渐减少并在30分钟内达到平衡，表明组装完成。加入清洗剂后，荧光在30分钟内逐渐恢复，表明串联体已完全分解。不同组的tHCR和gHCR在动态上表现出很好的一致性，这主要是因为在CAD规则中，每个区域的序列长度和组成一致。与gHCR和tHCR相比，具有相同区域1、2和3的传统HCR表现出相似的组装动力学，但如果没有区域4，即“尾部”或“间隙”，它就无法分解（图S5）。基于荧光标记的动力学研究进一步证实了tHCR和gHCR的正交性（图S6）。最后，我们表明tHCR和gHCR在不同的缓冲系统中具有良好的通用性，并且随着时间的推移具有良好的稳定性（图S7）。总之，上述结果表明tHCR和gHCR在体外都能很好地发挥作用。
3. 可逆HCR用于原位成像的可行性
我们接下来通过将HCR与免疫识别结合来研究可逆HCR用于空间蛋白质组学成像的可行性。按照图S8A所示的工作流程，我们使用化学交联剂（磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(磺基-SMCC)来合成PA-DNA缀合物。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结合物，通过观察一抗（b-肌动蛋白）与DNA引发剂结合后表观分子量的微小变化，证实了成功结合（图S8B）。通过用荧光团标记引发剂并在通过超滤分离后测量结合物的荧光强度（图S9），PA-DNA结合率计算为ca. 1:2。我们然后采用PA-DNA偶联物进行荧光成像。结果表明，所有九种制备的偶联物均可用于常规免疫荧光分析，表明一抗以高特异性和亲和力保持活性和免疫原性（图3A和图S10）。同时，偶联物的DNA起始子保持其启动HCR的活性，呈现细胞蛋白的放大原位荧光成像信号（图3B）。共定位研究表明，可逆HCR可以很好地与免疫荧光共定位，证明了可逆HCR的良好特异性（图S11）。需要注意的是，可逆HCR结果的荧光分布与免疫荧光结果略有不同，这应归因于大产物造成的偏差。简而言之，DNA聚合产生的信号放大与成像的保真度之间存在权衡：较大的聚合可以产生更好的信号放大，但同时会导致成像的偏差。这也是基于聚合的信号放大技术(HCR、滚动循环放大、SABER等)面临的共同挑战，应该通过引入其他创新概念来解决。
(A) 使用未扩增、gHCR、tHCR和常规免疫荧光(IF)对HeLa细胞上的b-actin、Ezrin、VDAC和a-微管蛋白进行共聚焦激光扫描显微镜图像。(B) ImageJ软件对(A)中所示图像的荧光强度进行分析的定量条形图。数据代表同一样品上不同区域之间荧光强度的平均值±SD（误差线）。比例尺，20 mm。
进一步的结果还表明，tHCR和gHCR对于原位荧光成像具有良好的正交性（图3C）。只有正交起始子触发相应的HCR并输出荧光成像信号。为了在单个成像周期内同时分析多种蛋白质，我们使用了三种具有独特激发 (Ex) 和发射 (Em) 波长的荧光团（FAM：Ex/Em = 494/518 nm，Cy3：Ex/Em = 552/570 nm，Cy5：Ex/Em = 643/667 nm；图3D）。通过比较独立成像（图3E）和同时成像（图3F），我们可以看到靶标蛋白质的定位和荧光强度相互吻合（图3G），表明这三种荧光团不会相互干扰并且可用于同时成像。良好的正交性应归因于CAD中不同HCR组之间可能的最低序列相似性。采用具有高序列相似性[大约80%的序列相似性：区域1、3和4为5/7 nt（相似性 = 71.4%），区域2为13/16 nt（相似性 = 81.2%）]的可逆HCR的交叉反应作为比较来验证序列相似性设计规则在CAD中的重要性。正如预期的那样，出现了显著的交叉反应（图S12），这导致成像结果严重混乱。先前报道的免疫SABER中使用的一些序列的相似性高达8/10 nt（80%），这在没有CAD的情况下是不可避免的，并且会导致交叉反应。
4. 扩增倍数比较
我们进一步研究了可逆HCR的扩增效应。首先，用荧光染料对两个HCR发夹(H2)中的一个进行修饰，以验证扩增效果。如图4所示，对于四种独立蛋白质的成像分析，包括b-actin、Ezrin、电压依赖性阴离子通道(VDAC)和a-tubulin，与未扩增组相比，tHCR和gHCR均将荧光信号增强了约65倍。tHCR和gHCR的荧光信号与常规免疫荧光相当，有利于后续成像。此外，通过用荧光染料修饰两个HCR发夹（H1和H2），可以实现额外的信号放大，表明可逆HCR在放大效率方面的可扩展性（图S13）。我们进一步研究了可逆HCR的定量性能。如我们之前的研究所述，我们研究了用粘蛋白1 (MUC1)的特异性抑制剂苄基-a-氮乙酰半乳糖胺(GalNAc)处理的乳腺癌-7 (MCF-7)细胞。如图S14所示，当靶蛋白表达改变时，蛋白质丰度与可逆HCR的荧光强度呈正相关，这与现有报告一致。虽然单个HCR的组装程度通常被认为是无法精确控制的，但这里的结果表明可逆HCR可用于靶标蛋白的半定量分析。此外，随着HCR技术的发展，最近报道了一种通过在复式发夹中引入碱基对错配来控制HCR组装程度的方法，这可能会提高HC量化的性能。
(A) 循环染色和脱色示意图。(B) 10个染色和脱色循环的共聚焦激光扫描显微镜图像。tHCR-1和tHCR-2分别用于b-actin（绿色）和Ezrin（红色）的循环成像。HeLa 细胞用4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)（蓝色）染色。(C到E) (B)图像的荧光强度统计结果。数据代表同一样品上不同区域之间荧光强度的平均值±SD（误差线）。N.S.，无显著性。比例尺，20 mm。
5. CAD-HCR的可逆性研究
我们接下来研究了可逆HCR用于扩展多重成像的能力。要实现这一目标，必须满足一个先决条件。也就是说，在每个染色和成像循环之后，必须彻底清洗荧光标记的HCR串联体，以避免在后续循环中残留荧光信号。我们采用两组tHCR（tHCR-1和tHCR-2）对两种靶蛋白（b-actin和Ezrin）进行循环成像（图5A）。在10个循环期间，成像结果显示几乎相同的染色模式，表明在不影响细胞形态的情况下实现了染色和脱色循环（图5B）。图5B中荧光强度的定量分析也显示了循环期间稳定的信号输出，证明一抗的抗原性和起始子的杂交能力也不受影响（图5，C至E）。循环期间稳定的信号输出表明，当严格控制反应时间时，整体信号是可控的。据推测，可逆HCR通过消除传统免疫荧光技术无法实现的不可逆信号衰减，赋予样品高可重复使用性。在各种实际应用中具有重要价值，特别是对珍贵的临床样本和实验样本（外泌体、细胞、组织、蛋白芯片等）进行长时间的重复分析。
(A) 单个细胞中九种蛋白质的循环成像示意图。(B)九种蛋白质通过三个成像周期的共聚焦激光扫描显微镜图像。第一个循环：VDAC（tHCR-1 和 FAM）、β-微管蛋白（tHCR-2和Cy5）和SIRT1（tHCR-3和Cy3）；第二个循环：b-肌动蛋白（tHCR-4 和 FAM）、FBLL1（tHCR-5和Cy5）和GM130（tHCR-6和Cy3）；第三个循环：核纤层蛋白B1（tHCR-7和FAM），Ezrin（tHCR-8和Cy5），和KDM1/LSD1（tHCR-9和Cy3）。(C) (B)中重建的伪色图像。(D) 在(C)中以红色虚线圈出的单个细胞中每种蛋白质的位置。比例尺，20 mm。
6. CAD-HCR辅助单细胞空间蛋白质组学成像
最后，通过使用可逆HCR，我们对分布在单个细胞内不同亚细胞位置的九种蛋白质进行了多重成像。蛋白质包括Ezrin（质膜标记）、b-actin（细胞骨架标记）、a-微管蛋白（细胞骨架标记）、Golgi matrix 130(GM130)（cis-Golgi 标记）、VDAC（线粒体外膜标记)、lamin B1（核膜标记）、赖氨酸特异性去甲基化酶 1 (KDM1/LSD1)（核标记）、Sirtuin-1 (SIRT1)（核标记）和Fibrillarin like 1(FBLL1)（核仁标记）。蛋白质印迹首先证实了HeLa细胞中存在这九种蛋白质（图S15）。如上所示，通过实验验证了10个正交系统，此处使用10个正交HCRs中的9个在三个循环内对九种蛋白质进行成像。如图6A所示，我们将九种蛋白质分为三组，每组中的三种蛋白质使用三组正交tHCR成像，分别用FAM（绿色）、Cy3（黄色）和Cy5（红色）标记。这里需要注意的是，同一组三个正交HCRs不能在成像周期中重复使用，因为在每个成像周期之后，抗体-起始子DNA偶联物不能被洗掉，如果应用相同的一组三个正交HCR，它们将在下一个周期引发相应的正交HCR，从而导致错误的输出信号。图6B显示了九种蛋白质在三个循环成像后的单独荧光图像，可以对其进行重建和重新着色以获得综合图像（图6C）。图6C中以红色虚线圈出的单个细胞也逐层显示在图6D中，以显示每种蛋白质的定位。如图所示，九种蛋白质的分布与其理论位置非常匹配。特别要注意的是，亚细胞蛋白的多重成像结果与亚细胞位置很好地共定位，显示了可逆HCR在蛋白质空间定位中的高精度。
讨论
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35030012/
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