科研（IF:18.998） |Kidney Int.：循环蛋白与糖尿病发展为肾衰竭风险之间的新关联

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编译：微科盟-三金，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

本研究应用一个大型蛋白质组学队列来寻找与糖尿病肾病患者肾衰竭发展相关的新循环生物标志物。我们跟踪了包括754名Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者以及早期和晚期糖尿病肾病患者在内的四个独立队列，以确定肾衰竭发展的标志。在十年的随访中，754人中有227人发展为肾衰竭。使用SOMAscan蛋白质组学平台，我们测量了1129种循环蛋白的基线浓度。我们再之前发表的研究中分析了其中334种蛋白质，这些蛋白质参与糖尿病肾病的特定候选途径，并发现35种蛋白质与发展为肾衰竭的风险密切相关。本研究中，我们使用非靶向方法检查了剩余的795种蛋白质。在这些剩余的蛋白质中，有11种与肾衰竭的发展显著相关。先前的研究报道这些蛋白质与神经元发育的生物过程有关(DLL1，MATN2，NRX1B，KLK8，RTN4R和ROR1)，并且与细胞和动物研究中肾脏纤维化的发展有关(LAYN，DLL1，MAPK11，MATN2，内皮抑素和ROR1)。进一步研究这些蛋白质参与糖尿病肾病发展的特定机制，可以评估其作为肾脏保护性治疗靶标的价值。我们使用多变量LASSO回归分析发现五种蛋白质(LAYN，ESAM，DLL1，MAPK11和内皮抑素)与发展为肾衰竭的风险独立相关。总之，我们的研究确定了可能是预测糖尿病肾病发展为肾衰竭风险的新候选预后生物标志物的蛋白质。此外，在评估所有SOMAscan结果时，选择其中三种蛋白质(DLL1，ESAM和MAPK11)作为候选生物标志物。

论文ID

原名：Results of untargeted analysis using the SOMAscan proteomics platform indicates novel associations of circulating proteins with risk of progression to kidney failure in diabetes译名：使用SOMAscan蛋白质组学平台进行的非靶向分析结果表明，循环蛋白与糖尿病发展为肾衰竭的风险之间存在新的关联期刊：Kidney InternationalIF：18.998发表时间：2022.08通讯作者：Andrzej S. Krolewski、Robert G. Nelson
通讯作者单位：美国马萨诸塞州波士顿乔斯林糖尿病中心遗传学和流行病学研究部；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学系；美国亚利桑那州凤凰城国家糖尿病和消化与肾脏疾病研究所慢性肾脏病科

实验设计

实验结果

1.研究队列的特征

根据设计，代表T1D(Ⅰ型糖尿病)和T2D(Ⅱ型糖尿病)以及慢性肾脏病早期和晚期阶段的4个独立研究队列在年龄，糖尿病病程，血糖控制，SBP(systolic blood pressure；收缩压)，ACR(albumin-to-creatinine ratio；白蛋白肌酐比)和GFR(glomerular filtration；肾小球过滤)方面存在基线差异。在Joslin队列中，88%的受试者是欧洲血统，而PIMA队列中的所有受试者都是美洲印第安人。在10年的随访中，754人中有227人发展为ESKD(end-stage kidney disease；末期肾病)。表1显示了在10年随访期间发展为ESKD及未发展为ESKD的个体的基线临床特征。在所有4个研究队列中都观察到，发展到ESKD的个体比那些没有发展的个体具有更高的HbA1c，SBP和ACR水平以及更低的GFR。

表1 研究队列的临床特征ACR，尿白蛋白与肌酐比值；DCCT，糖尿病控制和并发症试验；EGFR，估计肾小球滤过；ESKD，终末期肾病(即透析或肾移植)；GFR，肾小球滤过率；HbA1c，血红蛋白A1c；SBP，收缩压；T1D，Ⅰ型糖尿病；T2D，Ⅱ型糖尿病。^aP<0.05^bP<0.001^c对于Pima队列，使用硫代巴比妥酸尿清除率直接测量GFR(ml/min)^dP<0.01数据表示为SD±平均值或中位数(第25-75百分位)。对队列中10年内的非ESKD和ESKD患者进行了连续变量的Mann-Whitney U检验和性别比例的Fisher精确检验。

2.与ESKD风险相关的循环蛋白：非靶向方法

图2a显示了根据发展为ESKD风险相关蛋白质的浓度和P值绘制的OR火山图。与发展为ESKD风险相关的32种蛋白质显示出高度统计学意义(P<6.3×10^–5，用于多重比较Bonferroni校正阈值)。在这32种蛋白质中，有11种在每个研究队列中的受试者与发展为ESKD的风险密切相关，这些受试者也在第二阶段进行了测量。其余21种蛋白质与发展为ESKD的风险有关，但仅在一些研究队列中存在。这些蛋白质的进一步分析中没有报道。对每个研究队列中11种蛋白质进行单因素Logistic回归分析，结果显示在补充表S1中；其他21种蛋白质的结果显示在补充表S2中。

附表S1的调查结果的图形表示如图2b所示。尽管发现、复制和验证队列中的受试者患有不同类型的糖尿病和不同阶段的慢性肾脏病，但这些队列中11种候选蛋白与发展为ESKD(以OR表示)之间的关联非常相似。因此，我们将这些队列组合在一起进行进一步分析。在组合队列中，对每种蛋白质进行了多变量Logistic回归分析。这些模型根据性别、糖尿病病程、HbA1c、SBP、基线GFR和ACR进行了调整(图2b和补充表S1)。所有11种候选蛋白都与发展为ESKD密切相关。

图1 SOMAscan测量的两阶段研究设计∗括号中的数字显示了我们仅在发现队列的一半中测量的蛋白质数量。TGF β，转化生长因子β
图2 与10年终末期肾病(ESKD)风险相关的循环蛋白质的Logistic回归分析结果(a)效应大小(循环蛋白浓度每四分位数增加的优势比[OR])和关联强度(P值；y轴)与10年ESKD风险相关的火山曲线图。第二阶段考虑的蛋白质如图所示。共有32种潜在的候选蛋白与10年ESKD的风险显著相关。红色表示在所有研究队列中得到证实的11种蛋白质。(b)在每个队列(单因素Logistic分析)和联合队列中(按性别，糖尿病病程，血红蛋白A1c，收缩压，估计肾小球滤过率，和尿白蛋白与肌酐比值调整的多变量Logistic分析)，每四分位数的蛋白质水平每增加一个四分位数，就会出现10年ESKD风险的OR值和95%可信区间(CI)。另见补充表S1和表2。

3.候选蛋白的功能和生物学特性

由于目前的研究采用一种非靶向方法来选择DKD发展的机制或途径，所以我们使用生物信息学分析来搜索11种候选蛋白可能涉及的途径和功能。使用R包ClusterProfiler分析了来自博德研究所MSigDB的基因本体论(GO)基因集(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=GO)。该分析确定了9个与神经元发育相关的过程，包括神经元分化、神经发生、神经系统发育的调节、轴突发育、神经元投射再生、轴突损伤的反应、神经系统与突触前发育的负调控。这些过程含有11个候选蛋白质中的6个富含P<1.0×10^–2的富集物(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1[ROR1]，激肽释放酶8[KLK8]，经典Notch信号通路δ样配体1[DLL1]，内质网蛋白4受体[RTN4R]、神经毒素-1-β [NRX1B]和基质蛋白2 [MATN2])(表2)。11个候选蛋白质中的3个(Laylin[LAYN]、脂肪酸结合蛋白3[FABP3]和RTN4R)丰富了有机酸结合途径。有三种蛋白质没有在GO数据库的任何途径中均富集，即内皮细胞选择性粘附分子[ESAM]，丝裂原活化蛋白激酶11[MAPK11]和内皮抑素。

除了GO分析外，我们通过审查文献评估了这11种候选蛋白是否在细胞或动物研究的肾脏疾病病理学中有所报道。GO分析和审查文献综述的结果如表3所示。在综述中有一个重要发现，11种候选蛋白中的6种，即LAYN、DLL1、MAPK11、MATN2、内皮抑素和ROR1与肾纤维化相关。11种蛋白中的另外2种，ESAM和NRX1B，与肾小球中细胞的粘附有关。其余3种蛋白，FABP3，KLK8和RTN4R，以前没有报道与肾脏疾病有关。

表2 由11种候选蛋白质(基因)靶向基因富集的基因本体生物过程富含至少3种候选蛋白质的生物过程和P<1.0×10^–2被呈现ESAM，MAPK11和内皮抑素没有富集基因本体数据库中的任何生物过程
表3 根据生物过程与肾脏疾病机制的相关性分类的候选蛋白质N/A，不适用

4.候选蛋白作为发展为ESKD的预测因子

11种候选蛋白的相对浓度是相互关联的。我们观察到循环LAYN与神经元发育相关蛋白之间的相关性最强(图3)。因此，为了确定哪些候选蛋白质是ESKD 10年风险的最佳独立预测因子，我们进行了LASSO-Logistic回归分析。该模型包括11种候选蛋白质和临床因素，包括ACR，HbA1c和基线GFR。如图4所示，LAYN，ESAM，DLL1，MAPK11，内皮抑素，log2 ACR，HbA1c和GFR/10被选为一组可以预测ESKD 10年风险的生物标志物。为了研究这组生物标志物作为ESKD发展预测因子的性能，在组合队列中采用了多变量Logistic回归模型(n=754)。第一个模型仅包括通过Logistic回归分析选择的临床变量，并带有反向消除。在该模型中，包括了性别，糖尿病病程，HbA1c，SBP，eGFR和log2 ACR，并且只有3个变量作为10年ESKD风险的重要贡献者：eGFR，log2 ACR和HbA1c。第二个模型包括通过LASSO回归分析选择的一组生物标志物，包括3个临床变量。通过C统计量和连续的净重分类改进来评估这些模型的预后性能，并对每个模型进行接收者操作特征曲线分析，以确定灵敏度和特异性的最佳分界值。第一个模型(临床模型)的C统计量为0.847；第二个模型的C统计量增加到0.869。通过Uno一致性统计，从第一个模型到第二个模型的改进具有统计显著性(第二个模型与第一个模型：P=0.006)。根据持续的净重分类改进情况的评估，在第一个模型中增加LAYN、ESAM、DLL1、MAPK11和内皮抑素(第二个模型)后，导致再分类显著改善(净重分类改进：0.55；P<0.0001)，其中31%的事件正确再分类(P<0.0001)，23%的事件非正确再分类(P<0.0001)。

图3 Joslin队列中慢性肾脏病3期1型和2型糖尿病受试者的11种候选蛋白质的Spearman等级相关性分析∗∗∗P<0.001。DKD，糖尿病肾病
图4 使用惩罚最小绝对收缩和选择算子(LASSO)逻辑回归，选择蛋白质和临床因素的回归系数路径作为10年终末期肾病缩小到零风险的预测因子LASSO回归模型中共包含11种候选蛋白质和临床因子，并显示了8个选定变量的系数。最优λ是惩罚最大似然估计的惩罚因子，通过其最小水平的10倍交叉验证计算。每条曲线对应于作为收缩结果而选择的蛋白质，并在估计回归系数期间绘制收缩。LASSO惩罚回归系数的绝对值之和，并且系数为零的预测变量已从模型中排除，并且未在图中显示。临床模型的Logistic回归的统计量(血红蛋白A1c [HbA1c]、log2尿白蛋白与肌酐比值[ACR]和估计的肾小球滤过率[eGFR]/10)：0.847。通过LASSO回归分析(HbA1c、log2 ACR、eGFR/10、LAYN、ESAM、DLL1、MAPK11和内皮抑素)对所选变量的Logistic回归的C统计量：0.869。临床模型与新模型：C统计的差异，0.022(P=0.006)；净再分类改进，0.55(P<0.0001)。

5. JKS和Pima印度肾脏研究中的SOMAscan分析结果总结

为了评估当前发现的重要性，我们比较了11种新蛋白发展为ESKD的风险的OR与我们之前报告的其他35种蛋白质的OR。表4显示了我们每篇出版文章中报告的重要蛋白质的列表。在对基线HbA1c，GFR，log2 ACR和队列指标进行调整后，一些蛋白质的影响变得微不足道。这是在保护性蛋白质中看到的。在最初的报告中，研究结果缓慢或在10年的随访期间eGFR没有下降。表4所示的结果是从Logistic回归分析中获得的，其中发展为ESKD的是结果。排除8种保护性蛋白，所有其他蛋白质与发展为ESKD的风险具有高度统计学意义的相关性，蛋白质水平每增加1个4分位数，OR就在1.27和2.27之间变化。当前研究中确定的蛋白质与我们其他文献中的蛋白质相似，显示出统计学意义和对ESKD风险的OR。

46种ESKD相关循环蛋白中的许多都是高度相关的。为了确定那些相关性最小、对发展预后指标有价值的指标，我们进行了LASSO-Logistic回归分析。共选择了11种这样的蛋白质和3个临床变量作为ESKD的一组独立预测因子。重要的是，在目前的研究中鉴定出11种蛋白质中的3种，即DLL1，ESAM和MAPK11(表4)。所有这些蛋白质都可以被认为是候选生物标志物，以开发预后指标来识别具有ESKD高风险的糖尿病个体。由于研究队列太小，我们没有追求这样的目标。在表4中，我们将我们的发现与Ngo等人在普通人群队列中报告的发现进行了比较。研究中报告的46种ESKD相关循环蛋白中，有12种蛋白与Ngo等人报告的研究中eGFR下降呈正相关。考虑到研究之间的显著差异，该种一致进一步支持了我们研究结果的可推广性。作为结果，我们使用发展到黄金标准ESKD；他们使用了eGFR斜率，这是ESKD的替代项。我们只使用了早期和晚期DKD的糖尿病患者；他们研究了普通人群，其中一小部分受试者肾功能受损，一小部分受试者患有糖尿病。

表4 在Joslin肾脏研究和Pima印度肾脏研究中，SOMAscan测量的循环蛋白与发展ESKD密切相关ACR，尿白蛋白/肌酐比值；CI，可信区间；ESKD，终末期肾病；GFR，肾小球滤过率；HbA1c，血红蛋白A1c；LASSO，最小绝对收缩和选择算子；OR，优势比；TGF-β，转化生长因子β。^a在联合队列中，对经HbA1c、GFR、log2ACR和队列指标调整后的每种循环蛋白进行多变量Logistic回归分析(n=754)。对10年ESKD风险的影响大小(OR和95% CI)以蛋白质水平每增加1个四分位数表示。^bLASSO回归模型筛选出的蛋白质清单。^c对Ngo等人报告的基线估计GFR和ACR进行调整后，显著蛋白与估计的GFR斜率相关。^d对每个临床变量进行单变量Logistic回归分析的26个ORs。

讨论

使用宏蛋白质组学方法，我们发现11种以前未报道的循环蛋白与糖尿病发展为ESKD的风险相关。这些关联很强并在来自4个Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病队列中、不同慢性肾脏疾病阶段和不同种族的患者中得到了验证。虽然这些关联的机制目前尚不清楚，但发展为ESKD最终与肾脏中的组织重塑和纤维化有关，这些蛋白质可能以某种方式参与或与这些途径相关。

应用生物信息学分析和GO数据库，我们确定了6种候选蛋白质(DLL1，MATN2，NRX1B，KLK8，RTN4R和ROR1)与神经元相关途径的统计学显著关联。这一发现补充了我们最近的发现，即6个轴突引导途径蛋白(EFNA4，EFNA5，EPHA2，EPHB2，EPHB6和UNC5C)显著促进了ESKD的发展。总之，这两项研究的结果表明，神经元发育和修复相关蛋白在发展为ESKD(即组织重塑和肾纤维化发展)的机制中发挥着重要作用。可以推测这些蛋白质与ESKD风险之间的两种可能的机制。第一种是间接的，并假设候选蛋白质的循环浓度变化有助于神经病变的发展，特别是自主神经病变的发展。自主神经病变引起的肾脏结构和功能的改变可能导致肾损伤和进行性肾脏衰退。一些文献已经表明，自主神经病变与糖尿病肾功能下降的风险之间存在关联。第二种机制可能是候选蛋白质循环浓度变化对足细胞(肾小囊脏层上皮细胞)的直接影响。足细胞与神经元有许多相似之处，神经元是极化的，形成微管依赖的突起，具有基于肌动蛋白的突起(树突和足突)。除了这些形态学特征外，一些报告还强调了足细胞和神经元之间的功能和生化相似性，并且现在在足细胞中鉴定出越来越多的蛋白质，称为神经元特异性蛋白质。在显示严重蛋白尿的疾病模型中，NRX1B在足细胞中的染色强度降低，其染色模式转变为更不连续的斑片状模式。此外，ROR1是平面细胞极性途径的重要组成部分之一，可调节足细胞中的肌动蛋白重排，细胞形状，运动和肾素分布。更详细的循环候选蛋白水平升高与足细胞损伤之间的生物学机制还需要进一步的研究。

独立于生物信息学分析，文献综述鉴定出6种候选蛋白质(DLL1，MATN2，ROR1，LAYN，MAPK11和内皮抑素)与体内或体外肾纤维化有关。重要的是，前3种蛋白质也是多种神经元相关途径的成员，而后3种促纤维化蛋白质则不是，这表明它们与进行性肾功能下降的不同机制有关。其他2种候选蛋白ESAM和FABP3的作用既不能归类为神经元相关通路蛋白，也不能归类为促纤维化蛋白。

在单因素分析中，所有11种候选蛋白质都显示出与ESKD风险的强烈关联。然而，在多变量LASSO回归分析中，只有5种蛋白质，即LAYN，ESAM，DLL1，MAPK11和内皮抑素被选为发展到ESKD的独立预测因子。在这些蛋白质中，只有DLL1属于神经元相关的候选蛋白质。预测因子中没有其他神经元相关蛋白，很可能是由于它们的影响是由LAYN代表或解释的。LAYN的浓度与神经元相关蛋白的浓度高度相关。LASSO回归分析中发现的其他预测因子与神经元相关蛋白和LAYN的相关性较低，因此它们与ESKD风险的关联可能反映了它们参与其他生物学途径或不同的下游靶标。下面描述了被选为ESKD预测因子的5种蛋白质的临床相关特征。

LAYN是未来发展为ESKD的最强预测因子，但不幸的是，关于这种蛋白质的文献有限。LAYN是一种具有C型凝集素样结构域的跨膜蛋白，已被报道为透明质酸的受体。小鼠的研究表明，LAYN在包括肝脏，心脏，肾脏和脾脏在内的多个器官中表达。在一项体外研究中，LAYN参与了肿瘤坏死因子α诱导的肾小管上皮细胞的上皮-间充质转化，这意味着它可能参与肾间质纤维化的产生。LAYN信号传导也参与了炎症的增强。虽然我们的研究表明LAYN与其他神经元相关蛋白质具有很强的相关性，但没有文献表明可能的机制来解释这种关联。因此，循环蛋白LAYN的来源及其调控尚不清楚。

ESAM是免疫球蛋白超家族的成员，由血管内皮细胞选择性表达。据报道，ESAM在肾小球内皮细胞中高度表达，其水平在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中显著降低。重要的是，ESAM^−/−小鼠尿ACR明显高于ESAM^+/+小鼠，这表明ESAM调节了肾小球的血管通透性。然而，我们的研究表明，ESAM的循环水平升高与ESKD的高风险有关。我们无法调和这些不一致的调查结果。

DLL1是一种跨膜配体蛋白，与NOTCH 1-3受体的细胞外结构域结合。DLL1通过调节神经前体细胞的神经元分化，在不同水平上在中枢神经系统发育中发挥作用。此外，DLL1维持神经干细胞的静止，并在神经干细胞有丝分裂期间作为命运决定因素发挥作用不对称地分离为一个子细胞。研究表明，以DLL1作为配体的NOTCH信号通路参与了肾纤维化的发展。在肾小管细胞中该途径的激活对于肾纤维化的发展既必要又充分。在各种原发性疾病人肾组织中，肾小球硬化的程度、肾小管间质纤维化的严重程度和eGFR与通过足细胞和肾小管间质免疫染色评估的切割NOTCH1受体的表达相关。我们的研究首次揭示了DLL1升高在进行性肾功能衰退和发展为ESKD中的重要性。在我们的研究中，NOTCH1受体的循环水平与发展为ESKD无关(数据未显示)。

MAPK11是4个p38 MAPK之一，它们在细胞外刺激(如促炎细胞因子或物理应激)诱发的细胞反应级联中起重要作用，从而导致转录因子的直接激活。重要的是，p38 MAPK在葡萄糖诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转变中起重要作用。

内皮抑素是胶原XVIII的一个片段，在肾小球和肾小管周围毛细血管中高度表达。重要的是，内皮抑素参与衰老肾脏的纤维化有关。它是在细胞外基质重塑过程中形成的，具有抗血管生成作用，可能会导致损伤后肾脏修复受损。循环内皮抑素水平升高可能反映了内皮细胞的失调。在最近“控制心血管疾病行动”试验中的一项嵌套病例对照研究中，血浆内皮抑素预测了T2D患者在4.6年随访期间的肾脏结局。我们目前的研究将这一结果扩展到T1D患者和Pima印第安人。

这是我们的第五份报告，研究了在SOMAscan平台第一版上测量的循环蛋白与DKD患者发展为ESKD的风险之间的关联。之前的4份报告(H.Kobayashi，H.C.Looker，E.Satake等，2022年6月12日，Personal Communication)针对334种循环蛋白，这些蛋白被包含在4个候选途径中，这些途径可能对DKD的发展和发展很重要。其中35种蛋白质与发展为ESKD显著相关。这项研究的重点是在SOMAscan平台上测量的其余795种蛋白质。如上所述，发现与ESKD发展相关的11种循环蛋白是导致肾脏进行性衰退的疾病过程的重要标志物。然而，由于这些蛋白质中的许多是相互关联的，我们使用LASSO-Logistic回归来选择相关性最小的蛋白质。我们发现了5种这样的蛋白质，它们可以作为候选生物标志物，用于开发预测指数以识别ESKD的高危受试者。然而，在这项研究中，由于研究队列太小，我们没有试图开发这样的指数。

我们包括这篇报告在内的所有报告，都是纳入了多个不同的糖尿病患者队列，清楚地表明在所有队列中循环蛋白的异常都先于ESKD的发作。当前和先前研究发现的局限性在于，它们是从后续的观察性研究中得出的。因此，我们无法确定循环蛋白是否仅仅是ESKD发展的风险标志物，或者它们是否与此结果有因果关系。后者需要通过动物研究和临床试验来建立。此外，由于我们的研究队列数量很小，而不是基于人口，我们无法确定地评估候选循环蛋白的预后表现，并且生物标志物的临床相关性仍然不确定。需要对大型队列进行进一步研究和长期随访。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35618095/

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