科研 |南京中医药：糖尿病肾病的发病机理和丹参多成分联合治疗的机制（国人佳作）
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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读糖尿病肾病（DKD）是一种常见的糖尿病并发症。丹参对糖尿病并发症有显著的治疗作用，但其机制尚不清楚。本文利用生化指标和病理变化筛选出丹参多活性成分的最佳组合。代谢组学、转录组学和蛋白质组学被用于探讨DKD的发病机制。我们采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和平行反应监测靶向定量蛋白质组分析方法，研究丹参多活性化合物最佳组合的治疗机制。db/db小鼠出现生化异常和肾损伤。可能的代谢途径是类固醇激素生物合成和鞘脂代谢。我们通过基因网络将转录组中发现的727个差异基因与生化指标相关联，最终筛选出11个差异基因，它们主要是TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号通路的关键基因。丹参多活性成分组合能显著调节Egr1、Pik3r3和Col1a1基因。我们选择了11个参与这两条通路的差异表达蛋白，其中9个在db/db小鼠中与db/m小鼠相比发生了显著变化。丹参多生物活性化合物组合可回调Q9DBM2、S4R1W1、Q91Y97、P47738、A8DUK4和A2ARV4。综上所述，丹参多活性成分联合应用可通过调节TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号通路改善糖尿病患者的肾损伤。
论文ID
原名：Multi-omics analysis reveals the pathogenesis of db/db mice diabetic kidney disease and the treatment mechanisms of multi-bioactive compounds combination from Salvia miltiorrhiza译名：多组学分析揭示了db/db小鼠糖尿病肾病的发病机理和丹参多生物活性化合物联合治疗的机制期刊：Frontiers in PharmacologyIF：5.988发表时间：2022.09通讯作者：段金廒 & 宿树兰
通讯作者单位：南京中医药大学
实验设计
实验结果
自适应喂养2周后，db/db小鼠的平均空腹血糖水平（空腹8-12 h）约为11.1 mmolL−1，可被判定为出现糖尿病。然后它们被随机分组进行处理。表1 候选基因
在8周的丹参多生物活性化合物处理期间，我们记录体重和血糖水平（图1A、B）。db/db模型组血清FBG、TC、TG、BUN、Scr水平较对照组明显升高（图1C），这表明小鼠模型有明显的肾脏损伤。预防性治疗后，TJH、TJL、TGH、TGL、FJH、FJL、FGH、VJL和VGH组的血糖与疾病组相比呈下降趋势。多种生化指标水平呈现不同程度的回调趋势，尤其是VGH组，对所检测的六项指标均有显著的调节作用。TJH和TJL能显著降低肾损伤程度的重要指标BUN和Scr。同时，TJH和TJL对Ins有显著上调作用，可用于评估糖尿病的诊断和分类（图1C）。
如图2A所示，HE结果与生化分析一致。db/db模型组肾脏病变较对照组更严重，病理评分明显高于对照组（p<0.001）。肾组织广泛坏死，结构紊乱。肾小管结构消失，肾小管上皮细胞坏死。细胞核深染或碎裂溶解，如图2A中的黑色箭头所示；肾小球细胞坏死，结构紊乱，如红色箭头所示；可见少量肾小管坏死钙化，如绿色箭头所示；如黄色箭头所示，肾小管间质内可见许多炎症细胞。根据病理评分结果（图2B），多生物活性化合物联合用药后，除VGL组外，其他组的病变程度与疾病组明显不同。VGL组组织坏死面积较小，TJH、TJL、TGL、FJL、VJH和VJL组炎症细胞浸润面积较小。TGH、FGH、FGL和VGH组的组织形态学几乎恢复到对照组。
PAS染色可显示肾小球基底膜的增厚程度，已广泛应用于糖尿病的诊断和研究。PAS染色结果显示，与对照组相比，db/db组肾小球面积增大，基底膜增厚，平均光密度值显著升高（p<0.01）（图2C、D）。与疾病组相比，TJL组的平均光学值具有最显著的下调作用，TGL、FJL和VGH组的结果与空白组特别相似。表2 候选基因验证
2. 最佳比率筛选
我们根据生化指标和病理切片结果进行聚类分析（补充图S1）。结果表明，db/db模型组和对照组均被单独归类为一个类别，表明这两组可以显著区分。TJH组和TJL组可与阳性药物组分为一类。VGH组可分为二级阳性药物组。我们初步确定了最佳配比为，根据茎叶中的比率(TJ)对3个化合物进行配伍，以及根据根(VG)的比率对5个化合物进行配伍。
3. 代谢组学的变化
我们采用正交偏最小二乘判别分析对空白对照小鼠和模型小鼠的血清和尿代谢谱数据进行分析。与对照组相比，db/db小鼠出现代谢异常。我们根据其对VIP-plot数据集变异和相关性的贡献选择潜在标志物。VIP >1的代谢物通常被认为是差异代谢物。t检验（学生t检验）用于验证各组之间代谢物的差异是否显著。与对照组相比，db/db小鼠的血清和尿液样本中共鉴定出14种内源性代谢物和113种代谢物（补充表S5）。这些潜在代谢物被导入MetPA（https://www.metaboanalyst.ca/）和KEGG数据库，以分析相关代谢途径。血清样品代谢通路值较大，包括醚脂代谢和生物素代谢；尿样代谢通路值较大，包括泛醌和其他萜类醌生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢以及泛酸和辅酶A生物合成。类固醇激素生物合成和鞘脂代谢是血清和尿液样本中的共同途径（图3A）。如图所示，各组血清和尿液样本的PLS-DA评分图显示(图3B)，经丹参多活性成分联合治疗后，动物的异常代谢状况得到改善，TJ组和VG组受影响的代谢物趋于恢复正常水平。
表3 多生物活性化合物组合对差异候选基因的调控
4. 转录组变化
测序数据质量预处理结果见补充表S6。我们共发现727个差异表达基因，包括340个上调基因和387个下调基因。进一步分析显示，疾病组和对照组之间存在不同的基因簇（图4A、B）。无监督基因水平聚类证实了这一点，在比较db/db模型组和对照组时，显著上调和下调基因的不同模式被揭示（图4C）。我们获得差异表达基因后，进行基因本体（GO）富集分析，从生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）三个层面描述其功能（图4D）。分子功能水平分析显示糖尿病路径相关过程，包括UDP糖基转移酶活性、葡萄糖醛酸转移酶活性，类固醇羟化酶活性、单加氧酶活性和氧化还原酶活性。我们还通过KEGG数据库对差异表达基因进行了通路富集分析（结合KEGG注释结果），并通过超几何分布检验计算各通路入口差异表达基因的通路富集意义（图4E）。结果表明，参与糖尿病相关途径，包括花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢、类固醇激素生物合成以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化。
表4 靶蛋白的相对定量结果
5. 加权基因共表达网络分析
加权基因共表达网络算法（WGCNA）作为一种高效、准确的生物信息学和生物数据挖掘方法，得到了不断的改进和广泛的应用。在此，转录组中发现的差异基因与2型DKD模型中检测到的生化指标相关，并进一步构建基因网络。其他详情见补充材料。网络构建效力值的筛选结果如补充表S7和图5A、B所示。图5A为不同值对应的相关系数，图5B为不同效力值构成的网络平均连接性，结果表明，当效力值为14时，相关系数较高，网络的平均连接度也较高，因此，我们在随后的模块构建中使用的效力值为14。基于选择的效力值14，我们建立加权共表达网络模型，最终将15386个基因按不同颜色分为25个模块。灰色模块是一个不能归因于任何模块的基因集，因此它没有参考意义。每个模块中基因的数量如图5C所示，图的上部是由加权相关系数构建的dissTOM矩阵构造的基因聚类树。图5C的下部显示了每个模块基因的分布，相同的颜色代表相同的模块。如果两个不同模块的模块特征在基因上相似，它们将自动合并。我们采用Pearson相关算法计算模块特征基因和生化指标的相关系数和p值。在本实验中，生化指标与基因相关，包括体重、给药8周后的空腹血糖水平、甘油三酯、总胆固醇、血清肌酐和血清尿素氮水平。热图见图5D。在图5D中，纵轴表示每个模块，横轴表示每个特征。结果显示了模块和特征之间的相关性。我们发现，相关性趋势显著且不一致的两个模块是浅青色模块和青色模块；与空白组有9个显著相关的模块，包括棕褐色、浅橙色、品红色、红色、棕色、黑色、绿色、黄色和浅黄色模块。有三个模块与db/db模型组显著相关，包括浅绿色、深灰色和绿黄色模块。基于不同模块的重要性，我们结合网络基因数据库查询了每个筛选模块中前50个基因与DKD的关联(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），共鉴定出11个候选基因，包括Egr1、Foxo3、Pik3r3、Fgf1、Sost、Wnt10a、Tgif2、Akt2、Mep1b、Col1a1和Apoe（图5E），这些基因主要是TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号通路中的关键基因。基因的详细参数见表1。
6. 候选基因的实时荧光定量PCR验证
WGCNA分析结果通过实时PCR定量进一步验证。实验结果基于空白组的表达，通过FC值和p值评估疾病组与空白组之间的差异。FC>1.5或FC<0.67表明实验组与空白组之间存在显著差异。验证结果如表2所示。除Akt2基因外，其他候选基因的FC值在疾病组和空白组之间存在显著差异；Foxo3、Pik3r3、Fgf1、Wnt10a和Mep1b基因的p值显示出显著差异。丹参多活性成分联合治疗后，差异候选基因发生了不同程度的变化（表3）。二甲双胍与丹参中的多种生物活性化合物组合可能调节不同的分子途径来治疗DKD。阳性药物组可显著改变Foxo3、Fgf1、Sost、Akt2和Mep1b基因。TJ组和VG组均能显著调节Egr1、Pik3r3和Col1a1基因。
7. 蛋白质组学变化
根据Score Sequest HT>0和唯一肽的得分≥1，删除空白值，筛选结果如下：在可信蛋白1中发现3104个可靠蛋白；在letter蛋白2中鉴定出3107个信任蛋白；在原蛋白3中发现了3103个可信蛋白。我们在三组中鉴定出2637种可信蛋白质。在选择可信蛋白的基础上，结合指标函数进行差异筛选，我们对各组的3个重复值进行t检验，计算各组的差异倍数FC值和差异显著性p值；然后通过FC>1.2或FC<5/6和p值<0.05筛选差异显著的蛋白质。在将空白组与疾病组进行比较后，我们鉴定出539个显著差异蛋白。根据转录组和WGCNA对差异表达基因的分析结果预测和验证的两条相关通路，我们筛选出11个候选差异蛋白，Q91Y97（果糖二磷酸醛缩酶B）、Q91VB8（α球蛋白）、Q9DBM2（过氧化物酶体双功能酶）、P09411（磷酸甘油酸激酶1）、P26443（谷氨酸脱氢酶1，线粒体）、S4R1W1（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、P47738（醛脱氢酶，线粒体）、A0A087WS56（纤维结合蛋白）、和P52503（NADH脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白6，线粒体），分别对应于Hbb-bs、Lrp2、Aldob、Hba-a1、Ehhadh、Pgk1、Glud1、Gm3839、Aldh2、Fn1和Ndufs6基因。
8. 候选蛋白的PRM靶向定量蛋白组分析验证
平行反应监测（PRM）是选择性反应监测（SRM）的衍生技术。通过PRM技术，可以在液相分离过程中连续记录每个目标母离子的整个碎片离子图。与仅检测目标离子对模式的SRM相比，PRM检测所选母离子窗口中的所有碎片信息。导出目标肽的定量信息，蛋白质的定量值通过肽添加计算并用于组间统计分析。使用实验组和对照组的比率计算倍数变化，表4列出了每个蛋白质对应的基因。如图6所示，除了Q91VB8、P09411和A0A087WS56蛋白质外，疾病组的其他蛋白质与对照组相比显示出显著差异。阳性药物二甲双胍能显著回调P52503和P26443蛋白；TJH能显著回调Q9DBM2和P47738蛋白；VGH能显著回调S4R1W1、Q91Y97、P47738、A8DUK4和A2ARV4蛋白，这表明不同的药物可以通过调节不同的蛋白质来改善疾病的进展。
讨论
花生四烯酸代谢主要参与慢性炎症反应。根据生化指标和代谢组学的结果，我们推测体内长期高血糖水平会影响体内氧化激酶和蛋白激酶的表达，从而调节生长和转化因子的表达，导致生化指标水平异常，同时引起慢性炎症和代谢紊乱，如花生四烯酸和脂肪酸代谢紊乱。根据转录组学的结果，糖尿病肾病的发病机制可能涉及11个候选差异基因：Egr1、Foxo3、Pik3r3、Fgf1、Sost、Wnt10a、Tgif2、Akt2、Mep1b、Col1a1、Apoe。其中，Foxo3、Pik3r3、Fgf1、Akt2和Col1a1与PI3K/AKT/FoxO信号通路相关，Tgif2与TGF-β/Smad信号通路有关(https://www.kegg.jp)。根据转录组学的结果，我们选择了11个参与TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号轴的相关差异蛋白，并通过蛋白质组学进行了验证，包括A8DUK4（β珠蛋白）、A2ARV4（低密度脂蛋白受体相关蛋白2）、Q91Y97（果糖二磷酸醛缩酶B）、Q91 Y97、Q91VB8（α珠蛋白），Q9DBM2（过氧化物酶体双功能酶），P09411（磷酸甘油酸激酶1），P26443（谷氨酸脱氢酶1，线粒体），S4R1W1（甘油醛-3-磷酸脱氢酶），P47738（醛脱氢酶，线粒体），A0A087WS56（纤维结合蛋白），和P52503（NADH脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白6，线粒体）。
根据实验结果，TJ和VG组的治疗效果与阳性药物基本相似，初步验证了丹参多活性成分组合对DKD具有良好的治疗作用。经丹参多活性成分组合处理后，差异候选基因和蛋白质发生了变化。根据多组学和验证实验的结果，预测了丹参多活性化合物组合改善DKD的分子机制，涉及TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号轴。
Col1a1 (I型胶原α1链)是一个蛋白质编码基因，其相关途径包括血管紧张素激活ERK和胶原链三聚体化。与该基因相关的GO注释包括相同的蛋白结合和血小板衍生生长因子结合。在之前的实验中，我们还可以发现模型组中E-钙粘蛋白和TGF-β1的表达水平发生了显著变化。TGF-β1刺激Col1a1的表达以及磷脂酰肌醇三激酶（PI3k）和Akt的磷酸化。E-钙粘蛋白可诱导细胞内PI3k/Akt信号的激活，并通过抑制磷酸酶和血管紧张素同系物下调早期生长反应基因1（Egr1）。
体内高糖水平也会影响Q91Y97蛋白（Aldob基因）的表达，这可能进一步影响糖酵解糖异生、戊糖磷酸途径和三羧酸（TCA）循环。Q91Y97蛋白参与了从D-葡萄糖合成D-甘油醛3-磷酸和甘油酮磷酸的亚通路步骤。下调Q91Y97蛋白（基因Aldob）表达可以防止果糖诱导的甲基乙二醛过度产生和血管平滑肌细胞增殖。此外，果糖显著增加了碳水化合物响应元件结合蛋白（ChREBP）、磷酸化FoxO1/3α和Akt1水平。P26443蛋白（基因Glud1）是线粒体谷氨酸脱氢酶，将L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸，它通过产生α-酮戊二酸在谷氨酰胺补体中起关键作用，是TCA循环中的重要中间产物。此外，它可能通过增加兴奋性神经递质谷氨酸的周转而参与学习和记忆反应，并可促进小鼠β-细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌，但不促进基本胰岛素释放。
Lrp2是一种巨膜糖蛋白，属于低密度脂蛋白受体蛋白家族。Megalin是一种内吞受体，被认为是许多病理条件的重要组成部分，包括糖尿病肾病。在疾病状态下，megalin的表达可能严重受损，其机制可能与肾素-血管紧张素系统激活、TGF-β信号转导增加等有关。结果表明，db/db小鼠的Lrp2显著增加，VG组可以被显著恢复。
从上述因素出发，我们可以总结出丹参多生物活性化合物组合改善DKD的分子机制。多种生物活性化合物的组合可能通过调节TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号通路和异常蛋白表达来改善DKD，从而影响氧化应激、ECM胶原沉积和肾组织纤维化的过程（图7）。胶原的病理沉积被认为是肾纤维化的标志。体内高糖水平也会影响Q91Y97蛋白的表达，可以进一步影响糖酵解糖异生、戊糖磷酸途径和TCA循环。
结论
在本实验中，我们首次通过多组学方法揭示了DKD的发病机制。DKD的发病机制可能涉及11个候选差异基因以及TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号通路。丹参多活性成分联合应用可通过下调TGF-β/Smad和PI3K/Akt/FoxO信号通路，改善氧化应激、ECM胶原沉积和肾组织纤维化，改善糖尿病肾损伤。因此，我们的研究可能为DKD的临床诊断和治疗探索提供科学依据和支持，以应对这种疾病。
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