科研(IF:17.152) |Diabetes Care：组织蛋白酶D是1型糖尿病eGFR快速下降的生物标志物

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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

为了明确估算肾小球滤过率(eGFR)快速下降的机制是否对预测和治疗1型糖尿病(T1D)肾病具有重要意义。我们在四个T1D队列中进行了一项病例对照研究，以确定与eGFR快速下降相关的尿蛋白。病例和对照组分别根据eGFR下降大于等于3和小于1mL/min/1.73 m²/年进行分类。我们使用靶向液相色谱-串联质谱法测定与糖尿病肾病相关的20个蛋白中的38个肽，并且在人类队列和小鼠近端小管上皮细胞培养中确定了显著蛋白。该队列研究包括1270名参与者，平均随访时间为8年。在发现组中，只有组织蛋白酶D肽和蛋白对临床和实验室变量进行了充分校正。在验证组中，组织蛋白酶D与eGFR下降的相关性在最低限度调整的模型中得到了验证。在一项结合发现集和验证集的Meta分析中，组织蛋白酶D与eGFR快速下降相关的优势比为1.29/SD(95% CI 1.07-1.55)。在人类队列中，尿组织蛋白酶D与小管间质损伤相关，而小管间质组织蛋白酶D表达与皮质间质分数体积增加相关。在小鼠近端小管上皮细胞培养中，晚期糖基化终末产物-牛血清白蛋白(BSA)增加了组织蛋白酶D的活性以及炎症和小管损伤标志物，而组织蛋白酶D小干扰RNA(siRNA)进一步增加了这些标志物的表达。因此，尿组织蛋白酶D与T1D eGFR快速下降相关，并且可以反映肾小管间质损伤。

论文ID

原名：Urinary Proteomics Identifies Cathepsin D as a Biomarker of Rapid eGFR Decline in Type 1 Diabetes译名：尿蛋白质组学确定组织蛋白酶D是1型糖尿病eGFR快速下降的生物标志物
期刊：Diabetes CareIF：17.152发表时间：2022.06通讯作者：Christine P. Limonte通讯作者单位：华盛顿大学医学院、华盛顿大学肾脏研究所

实验设计

实验结果

1. 受试者的选取

1.1 JDRF人群(青少年糖尿病基金会人群)

JDRF生物标志物联盟进行的一项多国病例对照研究，分别是芬兰糖尿病肾病研究(FinnDiane)、哥本哈根糖尿病中心研究(Steno)、糖尿病并发症流行病学研究(EDC)和1型糖尿病冠状动脉钙化研究(CACTI)。

1.2 BKBC人群(波士顿肾活检队列人群)

在波士顿肾活检队列(BKBC队列)中， BKBC队列招募了2006年至2016年期间在波士顿地区三家医院进行了因肾活检的成年人。

1.3 Pima Indian人群(Pima印第安人人群)

从1965年到2007年，来自希拉河印第安人社区的Pima印第安人人群参与了一项关于糖尿病及其并发症的纵向研究。

1.4 KPMP人群(肾脏精准医学项目人群)

纳入肾脏精准医疗项目的DKD受试者在克利夫兰、达拉斯或波士顿招募， 活体切片检查是在活体供体肾脏灌注和植入受体前获得的。

2. JDRF生物标志物的蛋白质组研究

2.1 受试者的特征

基线时JDRF队列参与者的平均年龄为43岁、51%为女性、98%为白人(表1)。平均基线糖尿病持续时间为27.1年，平均糖化血红蛋白A_1c为8.5%。大多数受试者在基线时没有肾脏疾病，平均eGFR为94mL/min/1.73m²。大约36%的受试者的UACR大于等于30 mg/g，除吸烟史有29%的缺失外，协变量中缺失数据的百分比在小于1 ~ 4%之间。

表1. JDRF生物标志物联盟中参与者的基线特征，并对他们的尿蛋白质组学进行分析

数据为年龄、糖尿病病程、平均动脉压、收缩压、舒张压、体重指数(BMI)、糖化血红蛋白、eGFR、白蛋白与肌酐比值(UACR)、尿肌酐、eGFR斜率的平均值(SD)。数据包括性别、种族、吸烟史、视网膜病变状态、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEi)或血管紧张素II拮抗剂(ARB)使用、高血压诊断、UACR组和队列。百分比是按占总数值的百分比计算的。

在发现集中，随访期间病例和对照组的年eGFR斜率中位数分别为−4.3和0mL/min/1.73 m²。在验证集中，病例和对照受试者的年eGFR斜率中值分别为−4.4和0.1mL/min/1.73 m²。与对照组受试者相比，病例受试者更年轻，且eGFR和UACR基线值更高。在发现集和验证集之间，人口统计学和临床变量平衡良好。

2.2 尿蛋白与eGFR快速下降的关系

在发现集中，我们发现与eGFR快速下降显著相关的肽，在校正后的模型中，错误发现率小于0.05。在这些模型中，与eGFR快速下降关联最大的是两个与组织蛋白酶D相对应的肽。在完全校正的模型中，38个肽中只有1个组织蛋白酶D肽与eGFR的快速下降显著相关(优势比为1.44，95% CI为1.17-1.78)(图1A)。在20个蛋白中，我们发现在最小校正模型中有4个与eGFR的快速下降相关的肽，而在中等校正模型中有2个。其中，只有组织蛋白酶D在完全校正的模型中与病例状态相关(优势比为1.41，95% CI为1.14-1.74)(图1B)。

图1.在JDRF生物标志物联盟发现集中发现的尿肽(A)和尿蛋白(B)与eGFR快速下降的关系

结果经过基线年龄、性别、尿肌酐、糖尿病病程、降压药物使用、收缩压、糖化血红蛋白、UACR和eGFR的校正。FDR：错误发现率；OR：优势比。

在验证组中，尿液中的组织蛋白酶D肽段和组织蛋白酶D蛋白质的浓度与最小校正和中间校正的模型中eGFR的快速下降显著相关。在完全校正的模型中进行协变量顺序调整时，基础的UACR减弱了发现组和验证组中组织蛋白酶D蛋白和eGFR快速下降之间的相关性。

在发现集和验证集的Meta分析中，所有模型中组织蛋白酶D肽浓度和联合蛋白浓度都与eGFR快速下降显著相关(图2)。在完全调整的模型中，尿组织蛋白酶D与eGFR快速下降29%的比率相关(随机效应模型95% CI为1.01-1.55)。在验证集中，基础的蛋白尿或eGFR亚组未观察到显著异质性。

图2.在完全校正的模型中，对JDRF生物标志物联盟中组织蛋白酶D和eGFR快速下降之间的关系进行Meta分析

OR：优势比；TE：治疗效果；SE：标准误差。

3. 人类队列和肾活检数据

在BKBC队列中，随着间质纤维化、小管萎缩的严重程度的增加，观察到尿组织蛋白酶D浓度显著升高(表2)。随着纤维化间质中小管间质炎症的严重程度的增加，也观察到尿组织蛋白酶D浓度显著升高，但未观察到尿组织蛋白酶D浓度与肾小球或肾血管病变之间的显著相关性；而且血清组织蛋白酶D浓度与任何组织病理学病变的严重程度无关。在联合BKBC、健康肾脏研究和试点维生素D试验队列中，血清和尿液组织蛋白酶D浓度相关性比较小(r = 0.19)。

表2. BKBC中尿组织蛋白酶D与肾脏组织病理学特征的关系

我们用年龄和性别进行校正，并使用所有可用的组织病理学病变严重程度类别进行计算。组织病理病变严重程度缩小，形成平衡分布。计算原始的组织病理学病变严重程度的趋势检验P值。Cr：肌酐；Ref：所指对象。

在Pima印第安人人群队列中，来自微分离的肾活检标本的小管间质而非肾小球的组织蛋白酶D(CTSD) mRNA水平与皮质相对间质容积(VvInt)显著相关(r=0.35, P=0.018)(图3)。小管间质CTSD mRNA也与年龄(r=0.42, P=0.003)和糖尿病病程(r=0.36, P=0.013)显著相关，但未观察到肾小球CTSD mRNA与任何临床参数之间的显著相关性。

图3.在Pima印第安人人群队列中，小管(A)而非肾小球(B)的组织蛋白酶D mRNA表达与VvINT显著相关

mRNA表达水平经过log2转化。

在对10名患有DKD的肾脏精准医学项目(KPMP)受试者和18名活体供者的分析中，确定了25个肾细胞类型和组织原位免疫细胞的细胞簇。CTSD mRNA在这些肾细胞类型中普遍表达。在小管上皮细胞中观察到丰富的CTSD mRNA，包括三个亚群的近端管细胞、亨利袢升支粗段、亨利袢升支细段、远端曲管、集合管主细胞。CTSD表达在肾小球细胞，如足细胞、内皮细胞和系膜细胞。与活体供者相比，KPMP受试者与DKD相比，CTSD mRNA在近端小管细胞中表达更高(图4A)，同时平均表达水平显著增加(图4B)。

图4. LDs和DKD患者近端小管细胞中CTSD mRNA的表达

A、点图显示来自活体供体(蓝色)和DKD(粉色)肾脏近端小管细胞中CTSD mRNA的表达。颜色强度表示表达水平，圆点大小表示表达CTSD的细胞百分比。B、LDs和DKD患者近端小管细胞簇的CTSD平均表达水平。DTL：亨利袢降支细段；LD：活体供者；PT：近端小管。

4. 小鼠模型的研究

在8周和16 周时，Akita小鼠(一种糖尿病小鼠)的组织蛋白酶D尿酶活性均显著高于对照组，而血浆组织蛋白酶D活性没有差异。与对照组相比，Akita小鼠的肾小管和肾小球组织蛋白酶D的免疫荧光染色显示有更多阳性的染色。

5. 细胞培养的研究

与不同浓度的ctr-BSA或葡萄糖相比，100μg/ml和200μg/ml AGE-BSA处理MCT细胞(小鼠近端小管上皮细胞细胞系)，组织蛋白酶D和Lamp1的免疫荧光染色明显增加(图5A)。带有AGE-BSA的组织蛋白酶D似乎定位于溶酶体和细胞质，在图中分别显示黄色和红色的免疫荧光。

图5.小鼠近端小管上皮细胞研究

A、与5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖、100μg/ml ctrl-BSA、200μg/ml ctrl-BSA相比，100μg/ml AGE-BSA组组织蛋白酶D和溶酶体相关细胞膜糖蛋白(Lamp1)免疫荧光染色强度增加。B、与ctrl-BSA相比，用AGE-BSA处理时组织蛋白酶D酶活性增加。C和E、在100μg/ml AGE-BSA处理时，与转染对照小干扰RNA (ctrl-siRNA)的细胞相比，转染组织蛋白酶D小干扰RNA (CatD-siRNA)的MCT培养基中IL-1和KIM-1的浓度显著升高。在100μg/ml ctrl-BSA处理时，与ctrl-siRNA相比，CatD-siRNA使IL-1显著升高。D、用CatD-siRNA转染的细胞(AGE-BSA-MCT)与用ctrl-siRNA转染的细胞相比，IL-6的浓度增加，尽管这种差异没有达到统计学意义。

与ctrl-BSA处理后的细胞相比，用AGE-BSA处理MCT后培养基中组织蛋白酶D酶活性更高(图5B)。与对照siRNA相比，用AGE-BSA处理后还导致MCT细胞释放更多的(白介素-1)IL-1、(白介素-6)IL-6和(肾损伤分子-1)KIM-1。转染组织蛋白酶D siRNA的细胞在AGE-BSA中释放的IL-1和KIM-1明显多于转染对照siRNA的细胞(图5C-E)，同时也观察到IL-6也有着类似的趋势，但没有统计学差异。

结论

通过靶向蛋白质组学方法，我们发现在我们的大型多国家的T1D队列中，尿组织蛋白酶D与eGFR的快速下降有关。在随后的研究中，与健康的活体供者相比，DKD患者的近端小管组织蛋白酶D表达更高，而且糖尿病患者的尿组织蛋白酶D和小管间质组织蛋白酶D表达均与小管间质病理相关。此外，在小鼠近端小管上皮细胞中，用AGE-BSA处理细胞后增加了组织蛋白酶D的活性，增加了炎症和细胞损伤，通过阻断组织蛋白酶D的转录加剧了炎症和细胞损伤。总之，这些研究表明，在糖尿病中，肾组织蛋白酶D的产生是对病理分子通路激活的反应，尿液浓度升高可能提示早期小管间质损伤，导致T1D中eGFR快速下降。组织蛋白酶D是一种普遍存在的溶酶体酶，参与包括胶原蛋白和细胞内蛋白降解、凋亡和自噬等细胞稳态过程。溶酶体功能受损和自噬与炎症和氧化应激有关，并被认为是糖尿病肾小管间质和肾小球损伤的关键驱动因素。尿组织蛋白酶D增加在人类和动物糖尿病被渐渐知晓。此外，在人类和动物急性肾损伤和慢性肾脏疾病(CKD)的研究中，观察到与非特异性小管损伤相关的组织蛋白酶D肾组织表达增加。我们的研究建立在已发表的研究工作的基础上，通过证明T1D早期尿组织蛋白酶D排泄和随后eGFR下降之间的关系，表明溶酶体功能障碍可能在人类DKD的早期阶段很重要，并描述了尿组织蛋白酶D排泄的病理生理学特征。我们的随访研究结果表明，尿组织蛋白酶D在很大程度上反映了小管间质损伤。组织蛋白酶D在所有类型的肾细胞中表达明显，但在小管细胞中表达最多。在关注近端小管细胞类型时，与活体肾相比，DKD的KPMP受试者中的组织蛋白酶D表达更高。在Pima印第安人队列中，小管间质组织蛋白酶D的表达与VvInt直接相关，VvInt是小管间质损伤的标志，与线粒体功能障碍、炎症和小管代谢途径有关。在BKBC中，较高的尿组织蛋白酶D与更严重的间质纤维化和小管萎缩相关，这与肾脏疾病进展和纤维化间质中小管间质炎症的风险相关。我们观察到的血浆和尿液组织蛋白酶D缺乏相关性进一步表明，尿组织蛋白酶D主要来源于肾脏，这与已发表的观察结果一致，即组织蛋白酶D在人血清和尿液中具有不同的低聚糖模式。用AGE-BSA处理后增加了小鼠近端小管上皮细胞炎症标志物(IL-1、IL-6)和肾损伤标志物(KIM-1)的表达。高血糖环境的元素，即AGEs修饰的白蛋白和脂质分子，已知会干扰溶酶体蛋白降解和不同肾室的自噬通量，特别是近端肾小管。培养的近端小管细胞代谢AGEs修饰的白蛋白与未修饰的白蛋白不同，表明蛋白结合受损、细胞内降解以及溶酶体活性异常。AGEs与近端小管细胞上特异性AGEs受体的相互作用也会触发炎症和细胞内氧化应激通路，从而导致溶酶体功能障碍、自噬失活和细胞损伤。这些细胞内代谢紊乱的后果可能包括小管白蛋白重吸收受损和碎片化。增加的组织蛋白酶D可能是一种代偿性反应，在siRNA介导的组织蛋白酶D转录受阻后，AGE-BSA诱导小鼠近端小管上皮细胞中IL-1和KIM-1的升高。正如我们在BKBC和Pima印第安人队列中分别观察到的，组织蛋白酶D在小管间质损伤部位的大量产生和及其活性明显增加。用AGE-BSA处理小鼠近端小管上皮细胞后组织蛋白酶D和Lamp1免疫荧光染色均明显增加，并可能有组织蛋白酶D在细胞质中的释放。组织蛋白酶D的产生可能是由于AGEs的存在或增加的小管白蛋白(由于糖尿病肾小球滤过屏障的破坏)，以增加它们的降解，因为这两种产物都经过组织蛋白酶D的代谢。在我们的JDRF队列研究以及在其他大鼠和人类研究中，尿组织蛋白酶D升高与蛋白尿相关。组织蛋白酶D的增加也可能是由AGE触发的溶酶体膜通透性引起的。溶酶体膜通透性导致溶酶体功能障碍和自噬受损，从而导致细胞损伤。值得注意的是，在培养的肾小管上皮细胞中过表达组织蛋白酶D已被证明可以通过减弱AGE介导的溶酶体膜通透性和线粒体膜电位来保护细胞免受损伤。同样，组织蛋白酶D敲除小鼠模型显示，自噬损伤导致缺血/再灌注损伤和蛋白尿发生的易感性增加。然而，在其他使用小鼠急性和慢性肾损伤模型的研究中，组织蛋白酶D被认为是直接导致肾损伤的原因，抑制其表达可以减少小管细胞损伤和小管间质胶原沉积，虽然组织蛋白酶D活性的稳态控制对正常溶酶体功能和自噬很重要，但需要更多的研究来阐明其作用。我们的发现为溶酶体功能障碍提供了更多的证据，表明组织蛋白酶D的表达和活性的改变，是DKD病理生理的重要驱动因素。在eGFR快速下降的糖尿病患者和eGFR较低且蛋白尿较多的患者中，尿组织蛋白酶D升高可能反映了溶酶体应激和需求的升高，这有助于肾小管损伤和CKD进展。蛋白尿可能引发或加重小管损伤，这解释了为什么在JDRF队列中，蛋白尿降低了组织蛋白酶D和eGFR下降之间的关系。我们工作的优势是使用具有大样本量和纵向数据的特征明确队列，以及用靶向质谱法测量尿蛋白。研究进一步探索了组织蛋白酶D在DKD中的肾脏组织学相关性和潜在机制。我们工作的局限性队列主要是白人研究人群，对其他种族和民族群体的研究结果没有验证。eGFR斜率被用来定义病例对照状态，而不是临床终点，尽管最近的证据表明eGFR斜率可能是CKD进展的可行替代终点。回归均值可能会导致病例和对照受试者的错误分类。长时间的存储和不同测量批次的生物样品收集的不一致可能会影响肽的测量，我们的随访组织蛋白酶D队列研究样本量相对较小，可能存在混淆。总之，我们发现尿组织蛋白酶D(一种溶酶体蛋白酶)是与T1D人群eGFR快速下降相关的小管间质功能障碍的潜在指标。这项工作为溶酶体功能障碍在DKD中的重要作用提供了证据，对组织蛋白酶D和溶酶体/自噬通路的其他元素的进一步研究是非常必要的，以便更好地理解这些如何用于促进DKD诊断，并用于开发预防和治疗DKD的靶向疗法。
原文链接：  https://diabetesjournals.org/care/article/45/6/1416/144976/Urinary-Proteomics-Identifies-Cathepsin-D-as-a

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