科研 |BMC Microbiol：iTRAQ蛋白质组学分析揭示耐辐射奇球菌对12C6+重离子辐照的响应

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编译：微科盟-云阳，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）以其对各种环境胁迫因子的极强抵抗力而闻名，主要包括电离辐射（ionizing radiation，IR）、紫外线（ultraviolet，UV）照射、氧化应激和高温。虽然，已证实耐辐射奇球菌强大的DNA修复系统和抗氧化系统对其耐胁迫能力具有重要作用，但是几乎所有关于耐辐射奇球菌超强耐胁迫能力机制的研究都依赖于后处理恢复迟缓期的菌株，以确定所涉及的关键因素。目前，耐辐射奇球菌应激后其直接基因或蛋白质的变化尚未被表征。

在本研究中，我们对重离子辐照后的耐辐射奇球菌进行了蛋白质组学分析，探究耐辐射奇球菌中对IR快速响应的差异表达蛋白。经研究发现，与大肠杆菌（Escherichia coli）相比，耐辐射奇球菌对¹²C⁶⁺重离子辐照表现出极强的抵抗能力。利用基于iTRAQ（Isoobic Tags for Relative and Absolute Quantitation，同位素标记相对和绝对定量）的定量质谱分析方法，绘制了不同剂量¹²C⁶⁺重离子辐照引起的蛋白质组动力学变化图。结果显示，在重离子辐照下，452个蛋白存在差异表达且大部分蛋白表达上调，提示重离子辐照对翻译、TCA循环（Tricarboxylic Acid cycle，三羧酸循环）、抗氧化调节等功能具有上调作用。

本研究揭示了耐辐射奇球菌在¹²C⁶⁺重离子照射下的完整蛋白表达谱。最重要的是，比较耐辐射奇球菌经重离子辐照后与辐照后恢复阶段的蛋白质组，有利于更好地理解耐辐射奇球菌极强的辐射抵抗机制。

论文ID

原名：iTRAQ-based proteomic analysis of Deinococcus radiodurans in response to ¹²C⁶⁺ heavy ion irradiation译名：iTRAQ蛋白质组学分析揭示耐辐射奇球菌对¹²C⁶⁺重离子辐照的响应期刊：BMC MicrobiologyIF：4.465发表时间：2022.11通讯作者：徐平；吕志堂；谢琼通讯作者单位：国家蛋白质科学中心（北京）生命组学研究所；河北大学生命科学学院；中国航天员研究训练中心；安徽医科大学；贵州大学医学院；广州中医药大学第二临床医学院

实验设计

实验结果

1956年，首次从经4 kGy（辐照剂量是指被物质吸收的致电离辐射的总量，单位kGy是kilogray的缩写）电离辐射（ionizing radiation，IR）灭菌后仍变质的罐头肉中分离出耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）。不久后，人们发现指数生长期的耐辐射奇球菌甚至可以在高达5000 Gy的伽马辐射下存活，且不会失去活力或显示出任何DNA损伤诱导突变的迹象。在随后的几十年里，耐辐射奇球菌被认为是一种嗜极微生物，对IR、氧化应激、干燥和冷/热休克等各种压力源具有极强的抵抗力。暴露在诸如IR、UV辐射和干燥等极端条件下会导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，进而引起大量DNA损伤。50年多年的大量研究表明，耐辐射奇球菌超强的抗辐射能力得益于其高效的DNA损伤修复系统。转录组学和蛋白质组学分析发现，在应激条件下，耐辐射奇球菌中有几个响应DNA修复的基因/蛋白质，如RecA、GyrA、GyrB、UvrrA、UvrB、DdrA、DdrB、DdrC、DdrD和PprA。目前有研究表明，除DNA修复系统外，抗氧化防御系统也有助于耐辐射奇球菌抵抗辐射。耐辐射奇球菌的抗氧化系统保护其蛋白质组免受氧化损伤，使DNA修复系统和代谢系统正常运转。抗氧化系统包括内源性呼吸链酶的减少使耐辐射奇球菌中活性氧的合成减少、非酶促抗氧化剂（如锰络合物）、转录调控因子（PprM和PprI）和sRNA。蛋白质是细胞的最终功能实体，调节细胞表型和应激反应。最新的组学技术，特别是蛋白质组学研究为耐辐射奇球菌极强抵抗力的分子机制的揭示提供了有力的工具。在本研究中，基于iTRAQ定量质谱分析，我们对经不同剂量的¹²C⁶⁺重离子辐照处理后的耐辐射奇球菌进行了蛋白质组学分析。与以往主要是在辐照后恢复阶段所进行的研究不同，我们重点关注耐辐射奇球菌在重离子辐照后直接发生的蛋白质变化，从新的角度揭示其应激反应的分子机制。
1．¹²C⁶⁺重离子辐照对耐辐射奇球菌生长的影响
这一节中，我们检测了重离子辐照对耐辐射奇球菌生长的影响。我们使用不同剂量的¹²C⁶⁺重离子处理耐辐射奇球菌和大肠杆菌（E. coli K-12），不具有抵抗力的大肠杆菌K-12作为阴性对照。在低剂量¹²C⁶⁺重离子辐照后，大肠杆菌的死亡率显著增加，并在5 Gy剂量的¹²C⁶⁺重离子辐照下迅速达到最大值（高达95.8%）（图1A）。与以往研究（大肠杆菌DH5α在3 kGy剂量的γ辐射下未生长）相比，本研究表明¹²C⁶⁺重离子辐射可能对大肠杆菌具有极强的致死作用。而随着¹²C⁶⁺重离子的剂量从0 Gy增加到80 Gy，耐辐射奇球菌的死亡率逐渐升高，但即使在80 Gy的¹²C⁶⁺重离子辐照下，耐辐射奇球菌仍有生长，死亡率为49%（图1B）。然而，随着¹²C⁶⁺重离子辐射剂量从80 Gy增加到150 Gy，耐辐射奇球菌的死亡率逐渐降低，低至20%。这种现象被称为过度杀伤效应（overkill effect），此前在哺乳动物细胞中已有报道。以往的研究发现，电离辐射的细胞杀伤效应依赖于传能线密度（linear energy transfer, LET）和相对生物学效应（relative biological effectiveness, RBE），在LET约200 keV/mm时达到最大值，然后急剧下降，而那些极高传能线密度的重离子将进一步下降到小于1.0。与80 Gy和320 Gy相比，150 Gy的死亡率最低，说明辐射剂量为150 Gy时存在过度杀伤效应，且高LET时呈现出RBE的下降。上述研究结果表明，耐辐射奇球菌对重离子辐照具有极强的抗性，这与之前的研究报道数据相一致。图1 不同剂量重离子辐照下大肠杆菌（A）和耐辐射奇球菌（B）的致死率曲线
2．重离子辐照下耐辐射奇球菌的蛋白质组学分析
为了研究耐辐射奇球菌对重离子辐照的适应机制，我们通过iTRAQ定量分析方法检测了不同剂量¹²C⁶⁺重离子辐照下耐辐射奇球菌的蛋白质组学（图2A）。为此，分别提取0、20、80、160 Gy ¹²C⁶⁺重离子处理后的耐辐射奇球菌的全细胞裂解产物，用10% SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行分离。在这四个样本之间没有观察到显著差异，常表现出相似的模式。在附件1A中观察到清晰的高到低分子量蛋白条带，表明在相似浓度下提取的全细胞裂解物质量高。从这四个样本中提取的等量全细胞裂解物并加载到另一个SDS-PAGE上，分离后用胰蛋白酶消化，分别用iTRAQ试剂标记。分别用114 iTRAQ标记0 Gy重离子辐照样本，115 iTRAQ标记20 Gy重离子辐照样本，116 iTRAQ标记80 Gy重离子辐照样本，117 iTRAQ标记160 Gy重离子辐照样本（图2A）。不同标记的多肽按1:1:1:1的比例混合，用LC-MS/MS（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，液相色谱质谱联用仪）进行分析（附件1）。为了评估技术差异，我们将从0/20/80/160 Gy辐照样品中获得的相同蛋白质分成完全相同的两份，一式两份，这使我们能够确定在凝胶内消化、标记和后续分析过程中引起的差异。为了实现蛋白质组分析的深度覆盖和高置信度，我们采用MaxQuant（1.5.5.1）、pFind（version 3.1）和Proteome Discoverer（v2.4）这三个搜索引擎对iTRAQ的MS原始数据进行分析。每种搜索工具识别出的蛋白质数量都在2000以上（图2B）。共鉴定了2435个蛋白质（图2C），涵盖了Uniprot（version UP000076988）中近80%已注释的耐辐射奇球菌蛋白质组，对约91%的已鉴定蛋白进行了量化（图2D，附件2）。所有鉴定蛋白的平均序列覆盖率达33.18%，表明了本研究蛋白质鉴定的高度可靠性。对比三种搜索引擎所识别的蛋白质，共有的蛋白质数量达到2084个，分别占MaxQuant、pFind和Proteome Discoverer（PD）识别的总蛋白质数量的98%、88%和93%（图2C），不同软件具有相当高的识别一致性。因此，我们对经典的MaxQuant软件的分析结果进行进一步的定量分析。首先，我们研究发现经0/20/80/160 Gy辐照的样品在技术方面的重现性上没有明显差异。20/0、80/0和160/0 Gy的两次重复实验的标准差值分别为0.018、0.016、0.021、0.02、0.021、0.02（附件3），对应的R²值分别为0.809、0.677和0.784（附件4），说明我们的结果具有很高的重现性，实验过程得到了很好的控制。图2 重离子辐照后的耐辐射奇球菌的蛋白质组学分析A、重离子辐照处理的耐辐射奇球菌AS1. 3828的蛋白质组学分析流程。B、三种搜索引擎的蛋白质组学鉴定和定量汇总表。C、MaxQuant、pFind和PD所鉴定蛋白的重叠。D、耐辐射奇球菌的Uniprot数据库结果与我们数据集中所识别和定量的蛋白的重叠。
3．重离子辐照下耐辐射奇球菌差异表达蛋白的全局分析
箱线图显示了各测定方法的定量和中位数。8种分析方法之间没有显著差异，表明我们的数据集具有很高的稳定性（图3A）。我们发现，在不同的处理样本中，蛋白质丰度的动态范围很广，跨越约14个数量级（图3B），表明我们的蛋白质组学数据集的深度覆盖。在不同剂量的¹²C⁶⁺重离子作用下，2435个常用蛋白的整体蛋白质组变化显示了重离子辐照后蛋白表达的动态变化（图3C）。图3 重离子处理的耐辐射奇球菌蛋白质组学的定量稳定性A、不同处理方法的定量和中位数箱线图。B、4种处理方法中蛋白质强度范围的点图。C、4种处理方法的全局蛋白质组变化热图。
基于P值<0.05和和Log₂（Fold change）≥0.2的标准（图4A-C），分别在20/0、80/0和160/0 Gy中筛选出274、234和303个蛋白作为差异表达蛋白。在鉴定的差异表达蛋白中，20 Gy辐照时，175个蛋白表达上调，99个蛋白表达下调；80 Gy辐照时，160个蛋白表达上调，74个蛋白表达下调；160 Gy辐照时，203个蛋白表达上调，100个蛋白表达下调（图4D）。维恩图显示了113个在不同剂量重离子照射下不断变化的蛋白质，包括74个上调蛋白，39个下调蛋白（图4E）。使用STRING v11.5预测113个差异表达蛋白的分子间相互作用，分析产生了一个聚类系数为0.414的网络图，这表明113个差异表达蛋白也可能隶属于一个功能类型相似的类群。STRING分析显示，113个差异表达蛋白富集为3个簇（附件5），其中2个与翻译和碳代谢有关。因此，通过相互作用分析表明，在重离子辐照时翻译和碳代谢途径会立即受到调控。总之，共筛选出452个蛋白作为¹²C⁶⁺重离子处理后差异表达蛋白，其中大多数蛋白表达上调（图5A，附件2）。热图分析显示，与80 Gy剂量处理的样品相比，20 Gy和160 Gy剂量处理的样品的蛋白质组具有更好一致性。这一结果与不同剂量处理下的细胞生长状况相一致（图1B），在80 Gy剂量处理下，耐辐射奇球菌表现出最高的死亡率（高达50%），而在20 Gy或160 Gy剂量处理下，死亡率相对较低。这些结果进一步表明，在我们的数据集中鉴定的差异表达蛋白受到重离子辐照的调节，反映了在重离子处理下动态的细胞蛋白表达。另一方面，我们的蛋白质组学数据集还揭示了三种蛋白（DdrD、PprI和SsB）作为耐辐射奇球菌细胞从电离辐射影响中恢复的重要调节因子。根据已发表的结果，这三种蛋白在重离子辐照下均显著上调，进一步证明了我们的蛋白质组学数据集的可靠性。图4 20/80/160 Gy重离子辐照条件下差异表达蛋白的比较A-C、火山图显示了基于Log₂ (FC)>0.2和P值≤0.05筛选的差异表达蛋白，20 Gy、80 Gy和160 Gy均与0 Gy比较。D、各组差异表达蛋白的总结。E、各组差异表达蛋白之间的蛋白质重叠。
为了更好地了解差异表达蛋白可能参与的生物学过程和通路，我们进行了GO和KEGG通路富集分析。其中上调蛋白（304）主要富集在TCA、氧化还原过程和翻译调控中，而下调蛋白（148）主要参与转运调控（图5B&C）。上述结果与先前的研究相一致，据报道，在氧化应激、伽马辐照或高真空暴露时，氧化调节、翻译、TCA循环会高于正常水平，而ABC转运蛋白调控则被下调。这一部分，我们对304个上调蛋白进行了详细的分析，以更好地理解耐辐射奇球菌的IR抵抗机制。当我们的数据集中发现的上调蛋白与之前报道的应激条件下的上调蛋白进行比较时，至少有17个蛋白被确定在3个数据集中（图5D）。根据它们各自的作用，这17种蛋白质可以被分为许多组。第1组包括翻译调节相关蛋白Q9RY52 (RpsF)、Q9RY49 (RplI)、Q9RXJ3 (RpsQ)和Q9RST0 (RplL)。第2组包括GPT结合相关蛋白Q9RWN5 (FtsZ)、Q9RXK5 (FusA)和Q9RV32 (BipA)。第3组包括控制未折叠蛋白结合相关蛋白质Q9RWQ9 (GroEL)和Q9RY23 (DnaK)。第4组由参与DNA修复的关键蛋白质Q9RT53 (GyrA)和Q9RY51 (SsB)组成。第5组包括Q9RTU7 (Oligopeptidase A，寡肽酶A)、Q9RUP1 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、Q9RU54 (Isocitrate dehydrogenase，异柠檬酸脱氢酶)、Q9RTN7 (Aconitate hydratase A，乌头酸水合酶A)和Q9RR60 (Enolase，烯醇化酶)，它们都是参与肽或能量代谢的酶。最后一种蛋白质是Q9RWM2，一种未知蛋白。耐辐射奇球菌在不同胁迫条件下的翻译、伴侣蛋白、DNA修复和糖酵解途径都呈现一致的上调，表明这些途径在耐辐射奇球菌的胁迫响应中具有重要作用。图5 20/80/160 Gy差异表达蛋白的分析A、452种差异蛋白在不同处理方法中的关系的热图。B、304个上调蛋白的KEGG和GO富集分析。C、148个下调蛋白的KEGG和GO富集分析。D、我们的数据集与2011年伽马辐照数据集、2013年类核蛋白质组和2020年ROS蛋白质组的上调蛋白的比较。E、对我们数据集中唯一识别的226个上调蛋白进行KEGG和GO富集分析。
另一方面，在我们的研究中发现了226个独特的上调蛋白（图5D）。根据GO分析，226个独特的上调蛋白在rRNA结合、氧化调节和代谢相关的生物过程和分子功能中呈现显著富集（图5E）。表1中所示的10种蛋白质（包括7种氧化还原酶），说明了在重离子胁迫下，耐辐射奇球菌可能利用大量的氧化还原酶来保护蛋白质或核酸免受活性氧增加的影响，这些氧化还原酶的具体功能值得进一步探讨。表1 氧化还原酶活性通路有关蛋白

讨论

本研究采用基于iTRAQ的定量质谱分析方法，探讨了在¹²C⁶⁺重离子辐照下耐辐射奇球菌的细胞蛋白表达的变化，试图揭示其极强的抗辐射性的机制。据我们所知，我们的定量数据集揭示了耐辐射奇球菌在重离子辐照下直接且大规模的蛋白质组学特征，这是迄今为止第一次在高剂量重离子辐照下对耐辐射奇球菌进行大规模的定量蛋白质组学研究。在我们的蛋白质组学数据集中，大部分动态变化的蛋白暴露于重离子后表现为上调（图3C）。耐辐射奇球菌的IR抗性可能与重离子辐照后蛋白的上调有关。在我们的蛋白质组学数据集中，在重离子辐照下，鉴定出了304个上调蛋白和148个下调蛋白，共计452个差异表达蛋白（图5A）。据我们所知，这是迄今为止在耐辐射奇球菌中发现的差异变化最大的蛋白质数据集。在304个上调蛋白中，有78个蛋白在其它3个已发表的蛋白质组学数据集中被鉴定为共有蛋白（图5D），包括SsB、DdrD和PprI，已知它们与IR抗性有关。这些结果进一步证明了我们的蛋白质组学数据集的可靠性。此外，在我们的研究中有226个上调蛋白被唯一识别，占我们数据集中所有差异表达蛋白的74.3%（图5D）。这些上调的蛋白主要是细胞质的组成部分，参与与rRNA结合、氧化调节、抗生素的生物合成、氨基酸和次级代谢产物的生物合成以及其它细胞代谢调控相关的生物通路。在与抗氧化调节相关的蛋白质中，有7个是氧化还原酶，同时有1个蛋白质（Q9RW23）参与了抗氧化作用调控。剩下的两个蛋白分别是Q9RX79（参与电子转移调控）和Q9RV83（一种普通的应激蛋白）。我们的结果进一步表明抗氧化调节在耐辐射奇球菌的IR抵抗中起着至关重要的作用。在我们的研究中，304个对重离子辐照响应的上调蛋白主要富集在TCA、氧化调节、翻译和转运中（附件6）。Ott等人此前进行的一项蛋白质组学研究分析表明，在不同环境中，由高度真空诱导的耐辐射奇球菌的蛋白质在TCA循环、核苷酸切除修复、氨酰-tRNA生物合成和微生物代谢过程中显著富集。Basu等人进行不同的蛋白质组学分析，结果显示伽马辐射诱导蛋白与DNA修复、氧化应激反应、蛋白质翻译/折叠和细胞基本代谢功能调节的关键功能类别相对应。根据Xue等对耐辐射奇球菌转录组的研究，由于热应激而激活的基因主要参与应激刺激、蛋白质水解、氧化还原过程、DNA修复等生物过程。这些结果表明，某些生物学功能（如DNA修复、抗氧化调节和细胞代谢）可以在不同的数据集中被检测到，对耐辐射奇球菌适应各种各样的压力至关重要。此外，这表明耐辐射奇球菌可能利用同一套基因调控机制来应对各种刺激，从而产生抗逆性。最近，耐辐射奇球菌也被用于番茄红素和叶黄素的生产，由于番茄红素和叶黄素与美容和保健相关，作为天然食物成分来源引起了人们极大的研究兴趣。我们对耐辐射奇球菌进行蛋白质组学和代谢组学的研究，可能会揭示有趣物质的潜在新合成途径，为极端微生物未来在医疗保健和营养行业的应用奠定基础。综上所述，我们的研究为耐辐射奇球菌在重离子辐照下发生的细胞蛋白质组变化提供了全面的认识，这将有助于我们更好地了解该物种的抗辐射能力。这些重离子响应蛋白主要参与翻译、TCA循环、抗氧化和细胞代谢。进一步研究这些蛋白，特别是这些新发现的抗氧化相关蛋白的功能，将有助于我们更好地理解耐辐射奇球菌抗辐射能力背后的调节机制。原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36333788/

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