科研 |长春中医药：人参糖蛋白具有改善学习记忆的潜力（国人佳作）

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

据报道，人参具有多种有益的药理活性。人参糖蛋白（PGG）是一类从人参中提取的糖基化蛋白质组分，可对提高学习和记忆能力发挥重要作用。本研究的目的是通过蛋白质组学方法研究PGG介导的Notch信号通路对神经退行性疾病的保护机制。我们使用Morris水迷宫和筑巢行为实验评估了小鼠的学习和记忆；使用基于液相色谱-质谱（LC/MS）的多信息融合确定PGG结构；使用高级糖基化分析软件Byonic鉴定糖蛋白的准确糖基化位点。此外，我们通过糖残基的甲基化分析，阐明了寡糖链的连接模式；使用无标签定量蛋白质组学测量和比较野生型（WT）和APP/APS1小鼠之间的差异表达蛋白（DEPs），并鉴定相关信号通路。为了验证，我们进行了一系列体外测试，包括细胞生存能力评估、凋亡测定、定量实时聚合酶链反应和蛋白质印迹。在Morris水迷宫和筑巢实验中，PGG处理的WT小鼠表现出显著改善的学习和记忆。PGG中171个糖蛋白片段的结构符合可信评分，并使用LC/MS数据分析鉴定了典型结构。根据蛋白质组学分析结果，我们在模型组和给药组之间检测到188个DEPs，两个下调的DEPs与Notch信号通路有关。基于体外验证试验，PGG显著抑制了小胶质细胞Notch信号通路中关键蛋白的表达。PGG可以通过抑制Notch信号通路的过度激活来防止神经炎症的发生，从而抑制神经细胞凋亡。

亮点：1. 采用LC/MS-甲基化协同策略对人参糖蛋白进行结构分析；2. PGG在APP/PS1突变小鼠模型上显示出学习和记忆能力的显著改善；3. 无标签结果显示，与模型组相比，PGG处理后的蛋白水平有显著差异；4. PGG的活性可能与其抑制NOTCH信号通路、减少神经炎症发展密切相关。

论文ID

原名：Exploring the potential of ginseng glycoprotein to improve learning and memory in mice via Notch signaling pathway and structural analysis using multi-information fusion based on liquid chromatography-mass spectrometry译名：利用基于液相色谱-质谱的多信息融合技术，通过Notch信号通路和结构分析，探索人参糖蛋白改善小鼠学习记忆的潜力期刊：Journal of EthnopharmacologyIF：5.195发表时间：2022.11通讯作者：罗浩铭 & 朱迪夫
通讯作者单位：长春中医药大学

实验设计

实验结果

1. PGG的结构分析

1.1 PGG性质分析

如图1所示，使用干燥的人参，用70%乙醇提取，残渣经水蒸煮后，所得滤液采用D101大孔树脂洗脱并冻干，从而获得糖蛋白粗提取物，上清液在中空纤维超滤柱（10KDa）中超滤，最后用截留分子量5kDa的透析囊透析48小时，透析液浓酸冷冻干燥后，我们获得38.5 g PGG（产率0.77%，来源于5.0 kg干燥药材）。中性碳水化合物、酸性碳水化合物和蛋白质含量分别为38.9%、4.7和55.6%。使用具有差示检测器和GPC软件的HPLC测量分子量，我们注意到平均分子量为7723 Da，范围从5065到12062 Da，如图S2所示。根据单糖组成分析，PGG由半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fuc）、半乳糖醛酸（GalA）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）组成。PGG的糖组成分析结果如图S3所示。甲基化结果显示，→4)-Rha-(1→，→4)-Fuc-(1→，→6)-Gal-(1→，→4)-GalA-(1→，→4)-GlcNAc-(1→和→4)-GalNAc-(1→)是主链结构的主要组成部分。此外，(→3,6)-Man-(1→)分布在分支中，末端残基主要由(1→)-Fuc、(1→)-Glc和(1→)-GlcNAc或(1→)-GalNAc组成。氨基酸分析表明PGG由17种氨基酸组成，如下：Asp（7.98%）、Glu（10.58%）、Ser（2.23%）、His（3.31%）、Gly（12.48%）、Arg（39.45%）、Thr（1.77%）、Pro（9.38%）、Ala（5.32%）、Val（1.66%）、Cys（0.33%）、Met（0.13%）、Ile（0.75%）、Leu（1.24%）、Phe（0.78%）、Lys（1.47%）和Tyr（0.71%）。

图1 人参糖蛋白(PGG)提取流程图

1.2. LC-MS/MS分析

通过高分辨率质谱法鉴定糖蛋白包括两个步骤：母离子匹配和碎片离子匹配，如图2A所示。首先，我们通过母离子匹配识别候选糖肽数据集。根据收集的完整离子质量，数据库中所有寡糖和所有肽之间的所有质量组合被视为匹配的目标数据集。我们对数据集进行片段离子匹配以确定氨基酸序列和糖基化位点。在质谱数据库中，我们只鉴定了糖残基的数量，没有寡糖链的连接模式。基于甲基化分析数据和先前的文献报道，可以推断寡糖链的可能结构（图2B）。图2C显示了使用该策略进行人参糖蛋白结构分析的示例。通过计算母体离子峰[M+3H]³⁺，计算出人参糖蛋白片段的分子量为2052.9  Da。y和b片段之间的质量差异决定了氨基酸的类型和序列。基于b5和b6片段之间存在质量差（Δm），丝氨酸被鉴定为糖基化位点。为了精确匹配Δm，连接的寡糖链被鉴定为“Hex（1）HexNAc（1）”。通常，由丝氨酸连接的o-聚糖呈现三个核心结构，如图2B所示。因此，人参糖蛋白片段的结构被鉴定为“RSGSSS（-Gal-GalNAc）SSSSEDDGMGGR”。在质谱数据库中，我们匹配了171个可信评分（>60）的糖蛋白片段，属于52种不同的人参蛋白，包括糖基转移酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶、细胞色素、核糖体蛋白和叶绿体，如表S2所示。根据这些糖蛋白肽段中氨基酸的统计和计算，精氨酸的含量最高。尽管在PGG中仅鉴定了其中的几个片段，但统计结果与氨基酸分析结果一致。质谱法计算的分子量与GPC测定的分子量不同，因为质谱法匹配的人参糖蛋白片段仅占PGG的一小部分，无法反映整体情况。

图2 人参糖蛋白（PGG）的结构分析（A）糖基化位点的定位，（B）糖链的连接模式，以及（C）“RSGSSS（-Gal GalNAc）SSSSEDDGMGR”的结构鉴定。

2. PGG在改善学习记忆中的行为评价

考虑到MWM测试的结果，模型组表现出明显长于对照组的逃逸潜伏期（P < 0.05)。PGG中剂量处理（M）组、PGG高剂量处理（H）组和吡拉西坦治疗组均显著降低了学习试验第3天和第4天小鼠的逃避潜伏期（P < 0.05）（图3A）。与对照组小鼠比较，模型组小鼠首次穿越平台时间明显增加，而跨平台的数量减少；PGG可以显著改善这些参数，尤其是在PGG高剂量处理（H）组，如图3B–C所示。轨迹记录显示，AD模型小鼠在四个不同象限中花费的时间几乎相似；然而，PGG处理的小鼠在目标象限的时间比在其他象限的时间更长，导致平台位置的快速检测，如图3D所示。APP/PS1双突变小鼠已被广泛用作AD模型。通常，APP/PS1小鼠在6个月大时在大脑皮层显示Aβ沉积，随后出现慢性炎症，10-12月龄的神经炎症会导致神经元丧失和学习记忆能力受损。因此，我们使用10个月大的APP/PS1小鼠作为模型来评估PGG对AD样行为的改善作用。基于行为实验的结果，我们发现与野生型小鼠相比，未经处理的模型组小鼠的逃逸潜伏期显著延长，并且跨平台的数量显著减少，表明AD小鼠的学习和记忆能力较差。我们注意到PGG治疗组的学习和记忆行为显著改善。与我们的研究结果一致，如Wang等人所示，从人参中分离的寡糖和肽可以显著增强东莨菪碱诱导的大鼠记忆缺陷。此外，Luo等人已经表明寡糖组分不会影响记忆增强，而肽可以提供优异的性能。据报道，PGG可以改善大鼠海马内注射Aβ_25-35引起的学习和记忆障碍，并显示出抗SH-SY5Y凋亡活性。据我们所知，本研究首次报道了PGG对自发产生Aβ并表现出慢性炎症特征的APP/PS1小鼠认知功能的改善作用。

图3 PGG疗效的行为评估（A）MWM中的逃逸延迟。（B）第一次穿越隐藏的平台。（C）隐藏平台跨越数量。（D）大鼠在MWM中的运动。（E）筑巢行为。（F）筑巢得分。所有数据均表示为平均值 ± 标准差，n = 6。**P < 0.01，***P < 0.001表示与对照组相比有显著差异，##P < 0.01，###P < 0.001表示与模型组相比有显著差异。AD，阿尔茨海默病；MWM，Morris水迷宫；PGG，人参糖蛋白；WT，野生型。

3. 筑巢试验

我们进行筑巢试验以研究PGG对AD的治疗效果。与正常组相比，AD模型组小鼠的巢显示出松散、不规则、大而薄弱的区域，表明筑巢能力显著降低。与AD模型组相比，PGG处理的小鼠的巢呈现出紧凑和牢固的特征，这表明PGG可以显著改善模型小鼠的认知和行为

能力，从而突出PGG在AD治疗中的潜在有效性。高剂量给药组小鼠的筑巢性能与正常组最接近，优于其他给药组。结果如图3 E-F所示。

图4 治疗组和模型组的DEPs分析（A）频率分布直方图。（B）火山图。（C）聚类分析。（D）GO功能富集分析。（E）KEGG功能富集分析。DEPs，差异表达蛋白；GO，基因本体论；KEGG，京都基因和基因组百科全书。

4. 差异表达蛋白(DEPs)的鉴定

为了鉴定模型组和PGG处理组之间蛋白质组分的差异，我们采用了一种定量策略来根据质谱数据识别蛋白质。总共，我们从所有测试组中鉴定出4403种蛋白质，其中一些在一组中特异表达。我们在PGG治疗组中鉴定了508种独特蛋白，在模型组中鉴定出238种独特蛋白；其他蛋白在模型组和治疗组之间共有。DEP的定义基于1.5倍变化阈值（有倍数变化≥1.5或 ≤ 0.67，p < 0.05)。总的来说，我们在模型组和治疗组中发现了188个DEPs。与模型组相比，PGG处理组分别有149和39种蛋白上调和下调。

我们使用频率分布直方图分析无标签定量数据，纵坐标表示蛋白质的数量，横坐标表示两组样品的Log2倍变化（L2FC）（图4A）。L2FC是PGG处理组与模型组的定量log2比率的估计值。值为1.0表示PGG处理组的数量增加了2倍。如图4A所示，L2FC值主要分布在−2和2。火山图可以非常直观和合理地筛选两组之间的差异，从而实现DEPs的可视化。火山图中的每个点代表一种蛋白质。散点的颜色代表最终筛选结果：显著上调的代谢物用红色表示，下调的代谢物用蓝色表示，非显著不同的代谢物用黑色表示，如图4B所示。我们使用多个样本中表达模式的聚类分析来检测不同蛋白质的上调和下调。考虑到图4C，每一行代表一个蛋白质，每一列代表一个样本/重复，不同的颜色代表不同的表达水平。

图5 PGG对Aβ_25-35诱导的BV2细胞损伤的神经保护作用（A）Aβ_25-35和PGG联合处理后的细胞活力。数据表示为平均值 ± 标准差，n = 6.（B）不同剂量PGG对Aβ_25-35诱导的细胞凋亡的保护作用。（C）Aβ_25-35和PGG联合处理后BV2细胞的凋亡率。数据表示为平均值 ± 标准差，n = 3。（D）iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA表达水平。数据表示为平均值 ± 标准差，n = 3。***P < 0.001表示与对照组相比有显著差异，#P  < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001表示与模型组相比有显著差异。IL、白细胞介素；iNOS，诱导型一氧化氮合酶；PGG，人参糖蛋白；肿瘤坏死因子-α。

5. DEPs的生物信息学分析

5.1 GO功能注释分析与富集分析

我们进行GO功能注释和富集分析，以深入了解DEPs的生物学功能类别。GO是生物信息学中的一个重要工具。通过建立一组动态控制词，我们可以解释真核基因和蛋白质在细胞中的作用，以全面描述生物体中基因和基因产物的特性。GO有三个本体论：生物过程、分子功能和细胞成分。我们对已鉴定的DEPs进行GO功能注释分析，确定了19个生物过程、14个分子功能和12个细胞成分，如图S4所示。我们使用富集分析进一步确定两组之间存在显著差异的GO功能。GO功能标注分析结果以气泡图的形式呈现，每个气泡代表一个GO功能，如图4D所示。横坐标表示富集因子（GO分类中DEPs总数与GO分类中已识别蛋白质总数的比率），纵坐标表示GO术语描述，气泡大小表示蛋白质数量；大小越大，蛋白质数量越大。气泡颜色表示富集分析的P值，颜色为红色；P值越小，富集程度越显著。丰富因子的临界值设置为0。共有20个具有丰富因子值>0的GO功能被识别为潜在靶点，包括细胞外区域部分、酶抑制剂活性、止血负调节和分子功能调节。特别是酶抑制剂活性和酶调节器活性的GO分类在富集分析中表现出最高的影响因素，表明模型组和治疗组之间GO分类的差异最显著。

图6 NOTCH-1、NICD、Rbp JK、Hes-1、Hey-1、Bax、Cyto、caspase-3和Bcl-2的表达水平所有数据均表示为平均值 ± 标准差，n = 3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001表示与对照组相比有显著差异，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001表示与模型组相比有显著差异。

5.2 KEGG功能注释分析与富集分析

我们进行了KEGG功能注释和富集分析，以阐明DEP相关的生化代谢途径和信号转导途径。KEGG功能的图表分析与GO分析相似。使用KEGG功能注释分析，我们确定了DEPs的20条通路，包括Notch信号通路和AD。其中，9条通路仅参与DEPs的上调，4条通路仅涉及DEPs的下调，7条通路同时参与DEPs的上调和下调，如图S5所示。如图4E所示，在富集分析中，Notch信号通路以及补体和凝血级联具有最高的影响因素，表明模型组和治疗组之间这些代谢通路的差异最显著。KEGG分析揭示了Notch信号通路中的两种差异蛋白，Q92793（K04498）和Q9UM47（K20995），并且两者都被下调。蛋白质组学结果表明，Notch通路关键蛋白的差异表达可能是PGG改善学习和记忆的潜在机制。

5.3 同源蛋白簇分析(COG)

COG数据库允许对蛋白质进行线性同源分类。我们将识别的DEPs与COG数据库进行了比较，预测了这些DEP的可能功能，并对其功能进行了分类。总共确定了25个COG功能分类，包括5个信息存储和处理、10个细胞过程和信号、8个代谢和2个多特征，如图S6所示。横坐标表示COG数据库的功能代码。功能代码的描述显示在图的右侧，纵坐标表示每个功能代码的丰度值。不同功能组中蛋白质的比例反映了相应时期和环境的代谢或生理偏差，这可以通过研究对象在每个功能组中的分布来科学解释。在该图中，频率值最高的三种分类是信号转导机制（T）、仅一般功能预测（R）、翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣（O），表明这三种机制可能在治疗组中被诱导。

6. 体外验证试验

6.1 PGG对细胞活力的影响

我们进行体外实验以验证蛋白质组学结果。CCK-8测定用于评估Aβ_25-35损伤BV2细胞的活力。结果表明，模型组细胞活力显著低于对照组；然而，与模型组相比，PGG治疗组的细胞活力以剂量依赖性方式逆转，如图5A所示。这些结果表明PGG具有显著的细胞保护作用。

6.2 细胞凋亡分析

使用annexin-V-FITC/PI染色通过流式细胞术检测PGG对BV2细胞的凋亡作用。如图5B–C所示，与对照组相比，Aβ_25-35处理后早期（Annexin-V+，PI+）和晚期（Annexin V+，PI-）凋亡细胞的百分比显著增加。然而，PGG以剂量依赖的方式显著抑制Aβ诱导的细胞凋亡，0.3 mg/mL PGG可抑制细胞凋亡率到<15%。

6.3 PCR分析

qRT-PCR用于确认PGG是否抑制小胶质细胞炎性因子的mRNA表达。与对照组相比，Aβ_25-35处理的细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的表达水平显著升高，IL-10的表达降低。与模型组相比，PGG显著降低了iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平，并增加了IL-10的表达水平（图5D）。因此，这些数据表明PGG可以降低小胶质细胞中促炎因子的表达。

6.4 免疫印迹试验

基于蛋白质组学结果，我们推测PGG可以通过调节Notch通路来改善学习和记忆。因此，我们进行了蛋白质印迹分析，以验证NOTCH通路相关蛋白的表达水平。如图6所示，与对照组相比，Aβ_25-35处理上调了BV2细胞中NOTCH-1、NICD、Rbp JK、Hes-1和Hey-1的蛋白表达。在不同浓度的PGG处理后，NOTCH通路相关蛋白的表达水平下调，并呈现剂量依赖关系。为了评估PGG与凋亡之间的关系，我们检测了Caspase-3、Cyto-C、Bax和Bcl-2，结果表明PGG抑制了Caspase-3、Cyto-3和Bax的表达水平，同时上调Bcl-3的表达水平。这些结果表明PGG可以抑制Aβ_25-35诱导的BV2细胞凋亡。

NOTCH受体是该通路的中心元素，其传递的信号几乎影响所有发育中的组织和器官，并产生高度多效性的结果，在整个发育过程中以特定环境的方式影响分化、增殖和凋亡事件。据报道，与健康对照组相比，AD患者海马神经元中NOTCH免疫反应性显著增强，AD患者大脑中NOTCH蛋白和HEY1 mRNA水平升高。Li等人揭示，肉毒杆菌可以通过拮抗Notch信号通路的激活来减轻小胶质细胞的激活，并防止神经炎症的发生。据报道，糖原合成酶激酶-3β抑制剂通过下调Notch1和HES-1蛋白的表达来抑制Notch信号通路，在缺氧缺血性脑损伤后7天发挥神经保护功能，并抑制细胞凋亡。此外，Notch通路与炎症直接相关。此外，据报道，Notch通路在多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠中过度表达，并可增加Aβ积聚、细胞凋亡和神经炎症。组织病理学检查显示神经元变性，PCOS大鼠海马乙酰胆碱水平降低。脂蛋白LXA4可抑制Notch-1、Hes1、iNOS和CD32的表达，并降低促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达，这些都与M1小胶质细胞的分化有关。在本研究中，体外实验的结果表明，PGG显著抑制了小胶质细胞Notch信号通路中关键蛋白的表达。PGG显著降低促凋亡蛋白如caspase-3、Bax和Cyto的产生，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2的产生。这些结果表明，PGG可以通过抑制Notch信号通路的过度激活，从而抑制神经细胞凋亡，防止神经炎症的发生。

结论

总之，我们可以使用高级糖基化分析软件Byonic识别糖蛋白的精确糖基化位点。寡糖链的连接模式可以通过对糖残基进行甲基化分析来阐明。结合这两种互补的方法，我们成功地解析了PGG中具有高可信度水平的一部分糖蛋白，并对其属性进行了分类和描述。PGG可以改善APP/PS1小鼠模型中的学习和记忆，使用蛋白质组学方法来识别与记忆功能相关的DEPs。基于初步的体外实验，我们推测PGG的功能可能与下调NOTCH通路相关蛋白水平和抑制炎症因子释放有关，从而降低细胞凋亡水平。本研究的结果进一步拓宽了人参功效成分的范围，提高了人参的科技含量和经济价值。原文链接：  

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874122010170?via%3Dihub

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