科研 |中南大学&湖南中医药：肝脂质组学和蛋白质组学分析揭示了青钱柳黄酮预防小鼠非酒精性脂肪性肝炎的机制（国人佳作）

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

青钱柳是一种特殊的甜茶，由于其甜味和多种疗效，青钱柳叶在中国长期以来一直作为功能茶食用。先前研究发现，青钱柳叶茶（甜茶）在高脂血症患者中显示出显著的降血脂作用。其中，青钱柳黄酮（CPF）是其主要活性成分，具有降血脂、降血糖、抗脂肪和抗炎活性。然而，我们目前仍不清楚与脂代谢相关的生物标志物以及CPF改善非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的潜在机制。在此，我们将脂质组学与蛋白质组学相结合，以阐明其预防小鼠NASH的功效和相关机制。补充CPF（100 mg/kg）不仅显著降低NASH小鼠的体重和肝脏重量增加、胆固醇和三酰甘油（TGs）水平，并且不影响进食，而是通过显著降低肝脏炎症评分和肝纤维化面积，从而改善了肝脏脂肪变性。脂质组学表明，预防NASH的效果与TG、二酰甘油（DGs）和神经酰胺（Cers）水平的降低密切相关。此外，蛋白质组学还表明CPF促进了肝脏的代谢稳态。我们通过蛋白质组学和PCR验证了相关靶点乙酰辅酶A羧化酶1和I型胶原α1。上述发现表明，脂质稳态的再调节可能是CPF保护NASH的潜在机制的关键途径。

亮点：1. 补充青钱柳黄酮类物质可显著改善肝脏脂肪变性，具有明显的降脂、抗炎、抗纤维化作用；2. 脂质组学表明，预防NASH的有效性与肝脂质组学分析显示的甘油三酯、二酰甘油和神经酰胺水平的降低密切相关；3. 蛋白质组学和PCR结果显示CPF促进肝脏代谢稳态的相关靶点为乙酰辅酶A羧化酶1。

论文ID

原名：Hepatic lipidomics and proteomics analysis reveals the mechanism of Cyclocarya paliurus flavonoids in preventing non-alcoholic steatohepatitis in mice译名：肝脂质组学和蛋白质组学分析揭示了青钱柳黄酮预防小鼠非酒精性脂肪性肝炎的机制期刊：Journal of Functional FoodsIF：5.223发表时间：2022.11通讯作者：徐康平 & 王义坤通讯作者单位：中南大学和湖南中医药大学第一附属医院

实验设计

实验结果

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的特点是肝脏中积聚的脂质异常升高，导致肝细胞损伤和纤维化。NASH主要表现为代谢紊乱，出现炎症和细胞损伤，伴有或不伴有纤维化。因此，NASH是NAFLD的更具攻击性和危险性的形式，进而可发展为肝硬化甚至肝细胞癌。目前，尚无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的预防或治疗NAFLD或NASH的疗法。因此，NASH因其高发病率、复杂的发病机制和缺乏有效药物而面临巨大挑战。

图1 生化分析和组织学分析评价CPF治疗非酒精性脂肪性肝炎的疗效（A）肝组织HE染色切片的显微照片（放大400倍）。（B）天狼星红染色肝脏组织切片的显微照片（放大400倍）。（C）脂肪变性区域。（D）纤维化区域。（E）炎症评分。（F）NAS评分。（G）血浆丙氨酸转氨酶（ALT）活性。（H）血浆天冬氨酸转氨酶（AST）活性。（I）血浆碱性磷酸酶（ALP）活性。（J）血浆总胆汁酸含量。

1. 补充CPF对AMLN（Amylin肝NASH）饲料诱导的肝脏脂肪变性具有保护作用

与长期正常饮食的对照小鼠（C）相比，喂食AMLN饮食的NASH小鼠的体重和肝脏重量显著增加，与NASH小鼠相比，CPF处理可以降低体重和肝脏的重量（图1A - 1C）。诚然，高脂血症是公认的NASH危险因素。我们使用生化分析评估CPF调节血清中脂质代谢的效果，如图1所示。生化分析显示，与对照小鼠相比，模型小鼠表现出高血脂，这是由血清总胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）浓度的明显增加确定的（P<0.05）。有趣的是，与NASH组相比，补充CPF显著降低了血清胆汁酸、CHO和LDL水平（P<0.05），但不影响血清TG水平（图1A - 1C）。此外，与NASH小鼠相比，补充CPF可以降低肝脏TG和CHO水平（图1G - 1H）。

NASH是一个严重的公共健康问题，与高脂肪和高糖饮食有关。AMLN饮食确实是高脂肪、高胆固醇、高糖饮食，之前的研究证实，AMLN饮食可以诱导大鼠和小鼠的NASH，这与临床NASH和代谢综合征的两个方面都相似。诚然，异常的脂质代谢、炎症和纤维化也参与了NASH的发展。与长期正常饮食相比，如HE染色所示，用AMLN饮食喂养的模型小鼠出现了大细胞脂肪变性、肝小叶炎症、气球状变性、纤维化和mallory小体，这表明NASH模型已经被成功构建。然而补充CPF可以显著减轻肝脏脂肪变性、炎症和纤维化，表明CPF可以防止NASH通过抗脂肪变性、抗炎和抗纤维化途径（图2A - 2D）。NASH小鼠通常表现为肝功能受损，表现为转氨酶升高。一致地，与对照小鼠相比，本模型中的NASH也显示出明显的肝细胞损伤，如AST、ALT和ALP水平显著升高所示（图2E-2G）。更重要的是，补充CPF可以通过降低转氨酶来改善NASH小鼠的肝损伤。总之，补充CPF通过调节脂质代谢、抗炎和抗纤维化来预防NASH。

图2 生化分析评价CPF对非酒精性脂肪性肝炎的降脂作用（A）体重变化（B）肝脏重量。（C）肝脏重量比=100%*肝脏湿重/体重。（D）血浆TG含量。（E）血浆CHO（F）血浆LDH含量。（G）肝脏TG含量。（H）肝脏CHO含量。

2. 脂质组学分析表明，CPF的补充促进了脂质代谢的平衡

代谢紊乱，特别是脂质代谢紊乱，是导致NAFLD和NASH发病的主要因素。NAFLD是多种代谢途径紊乱的结果，主要涉及TGs的肝内积聚。这些畸变特征可能决定了NAFLD是否发展为NASH。NASH的特点是炎症/纤维化患者肝脏脂质的积聚。

最近，脂质组学方法提供了NASH代谢途径改变的坚实证据。除生物化学和病理学外，我们进一步分析了基于超高效液相色谱串联质谱/质谱（UPLC-MS/MS）的脂质谱，以表征NASH中的脂质代谢功能障碍，从全局视角挖掘复杂多样脂质中的药效生物标志物。我们首先在来自对照、NASH和CPF小鼠的肝组织中测定了总共1303种脂质类化合物，包括20.92%的TGs、21.77%的磷脂酰胆碱（PCs）、12.66%的磷脂酰乙醇胺（PEs）、7.85%的二酰甘油（DGs）、7.09%的鞘脂（SMs）、3.71%的磷脂酰肌醇（PIs）、3.54%的磷脂酰胆酸（PCs）和其他。无监督PCA分析最初用于区分对照组、NASH组和CPF组之间的脂质代谢表型。PCA模型的得分图中观察到了不同的脂质表型，表明AMLN饮食喂养后发生了脂质代谢紊乱，CPF处理可以调节脂质代谢（图3A）。同样，层次聚类分析（HCA）模型也显示出明显的组间分离和组内聚集，进一步证实CPF处理可以改善AMLN饮食引起的脂质代谢功能障碍（图3B）。

图3 基于脂质组学分析，无监督的多变量统计分析可区分脂质代谢表型（A）PCA模型在所有组中均表现出脂质代谢表型。（B）HCA模型在所有组中均表现出脂质代谢表型。

为了评估补充CPF对脂质代谢的影响，我们通过监督的PLS-DA模型分析了三组之间的重要差异脂质代谢产物。成功建立了偏最小二乘回归分析法（PLS-DA）模型，其验证参数包括可预测性为（Q2 = 0.974）和适应度为（R2X = 0.578和R2Y=0.986）（图4A）。200次置换检验[R2 =（0.0，0.303），Q2 =（0.0，− 0.324)]也证实了PLS-DA模型的可靠性（图4D）。上述建模参数表明，建立的PLS-DA模型显示出良好的拟合性，适用于充分挖掘脂质变量和筛选脂质代谢谱中的功能性生物标志物。我们在PLS-DA评分图中观察到明显的组间分离，表明AMLN饮食和CPF引起的脂代谢紊乱。根据VIP排序，负责组别区分的不同脂质代谢产物位于外圈（图4C）。单因素方差分析还分析了与表型分离相关的组内差异。

表1 CPF调节的差异脂质标志物

此外，我们在单因素方差分析中使用P＜0.05，以及PLS-DA模型中（模型组/C）≥ 2和（CPF/模型组）≤ 0.5和VIP≥1的标准，这三组中来自七个主要类脂类的49种不同脂类的水平，与ND组相比，包括21个DGs、9个Cers、5个TGs和2PCs [PC（20:5/22:5）和PC（O-16:2/20:3）]显著升高，并且通过补充CPF显著降低（图5C）。14种不同的TGs包括TG（12:0/12:0/22:2）、TG（12:0/14:0/18:1）、TG（14:0/16:0/16:1）、TG（16:0/16:0/18:2）和TG（16:1/16:16:1），21个不同的DGs包括DG（15:0/18:1/0:00）、DG（16:0/16:1/0:00），DG（16:0/18:1/0:00），DG（16:1/22:4/0:0），DG（17:0/18:4/0:0），DG（17:0/20:5/0:0）、DG（17-1/20-1/0:0）和DG（17:1/22:6/0:0）、DG（18:1/20:0/0:0）、DG（18/1/201/0:0）和DG（18:1/22:0/0:00），DG（18:1/22/1/0:00）、DG（18:1/204:1/0:00），DG（20:0/18:1/0:00）和DG（20:1/18/2/0:00）。综合而言，上述结果表明，CPF的脂质代谢调节特别涉及降低NASH中DGs、Cers、TGs和PC型脂质的水平，37种脂质可能被表示为CPF降脂作用的潜在生物标志物（表1和图5）。此外，与之前的研究一致，临床肝脏脂质组学也证明，随着脂肪变性的增加，TG、DGs和Cers种类的增加，发生了实质性改变。这些脂质种类在血浆中也随着肝脏脂肪变性的增加而增加，并与肝脏脂质表现出显著的相关性。这些改变的脂质标志物可提高临床对NASH的诊断准确性。

图4 使用PLS-DA模型筛选与疗效相关的显著差异脂质种类（A）监督PLS-DA模型。（B）200次置换检验验证了模型的可靠性。（C）根据VIP值筛选不同脂质种类的散点图。（D）DG（17:0/18:4/0:0）。（E）TG（18:1/18:1/22:00）。

脂质代谢紊乱是NASH的重要病理表现之一，根据“二次打击”假说，肝细胞内TG过度积累(由于输出减少、合成增加或两者兼有)，接着是第二步(或“打击”)，可能导致NASH。后者可能与脂质过氧化、氧化应激、炎性细胞因子产生增加、肝星状细胞活化和凋亡有关。TGs在肝细胞中的积聚是游离脂肪酸流入增加和新生脂肪生成的结果。脂肪变性导致脂肪毒性，导致肝细胞凋亡、坏死、炎症形成和氧化应激。随后的慢性损伤激活了纤维化反应，甚至最终导致终末期肝病。因此，调节脂质代谢可能是预防和治疗NASH，特别是肝内TG增加的一种有前景的策略。值得一提的是，我们首次发现CPF可以促进NASH小鼠肝内TGs的积累，改善脂质代谢紊乱。

图5 显著差异脂质种类的热图

3. 蛋白质组学分析表明，补充CPF可改善肝脏脂质代谢，预防肝纤维化

肝脏是负责脂质代谢的主要器官，因此，我们还通过蛋白质组学分析筛选了与疗效相关的肝脏靶蛋白。我们总共从小鼠肝脏中定量鉴定了3615种蛋白质，并在火山图中显示了定量结果。根据模型与CPF组的比较，我们使用火山图初步筛选了202种差异蛋白，补充CPF可上调NASH小鼠中的112种蛋白水平，下调90种蛋白水平，如图6所示。此外，根据VIP > 1，我们采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型进行表型区分和差异蛋白筛选（图6A-6D）。与火山图一致，我们使用OPLS-DA模型筛选了735种差异蛋白（图6E）。最后，综合考虑火山图和OPLSDA模型，我们选择相交叉的65个蛋白质作为生物标志物，最显著不同的蛋白质是乙酰辅酶A羧化酶A（ACCA），如图7所示。我们通过PCR和蛋白质印迹进行靶向验证。

图6 使用OPLS-DA模型筛选与疗效相关的显著差异蛋白质种类（A）监督OPLS-DA模型。（B）200次置换检验验证了模型的可靠性。（C）根据VIP值筛选差异蛋白质种类的散点图。（D）排名前20的差异蛋白。（E）火山图筛选出不同的蛋白质种类。（F）显著不同脂质种类的热图。

目前，从头脂肪生成已被公认为脂肪酸代谢中的重要作用，并明显促进NASH患者肝细胞内TGs的积累。因此，从头脂肪生成在肝脏脂肪变性的发病机制中起着重要作用，并且似乎与肝内炎症和纤维化有关。乙酰辅酶A羧化酶（ACC）是治疗NASH和NAFLD的多功能靶点，将乙酰辅酶A生物转化为丙二酰辅酶A，这是从头脂肪生成的速率控制步骤。因此，抑制ACC在药理学上已通过同时抑制从头脂肪生成和刺激脂肪酸氧化，为NAFLD提供了一种有吸引力的治疗策略。此外，ACC抑制不仅可以逆转NAFLD和肝脏胰岛素抵抗，还可以通过扰乱肝星状细胞激活时的代谢重编程抑制肝纤维化，显著减少NASH小鼠的纤维化。重要的是，CPF可以通过抑制肝ACC的表达来预防NASH，这表明ACC可能是CPF预防NASH的潜在重要靶点。

图7 （A）ACCA蛋白表达。（B）ACCA基因表达。（D）COL1A1蛋白表达。（E）COL1A1基因表达。

4. 验证相关基因

近年来，乙酰辅酶A羧化酶（ACC）已成为NASH治疗的最有前景的靶点之一，值得一提的是，ACC1的表达通过PCR从基因水平得到了验证。PCR和蛋白质组学均证实，CPF处理显著降低了ACC1的表达。我们需要进一步研究ACC1和脂质种类之间的关系。

NASH是NAFLD中更具危险性的亚型，据估计到2020年将成为肝移植的主要原因。除脂质紊乱外，炎症和纤维化都是NASH的重要表现。纤维化的存在是NASH患者死亡率的最强预测因素（非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的治疗）。白细胞介素6（IL-6）是NASH的重要炎症标志物，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原α1（COL1A1）和金属肽酶抑制剂1（TIMP-1）是NASH的纤维化标志物。此外，CPF显著降低了COL1A1和ACCA的表达，如图7所示。由于NASH的病理复杂性，降脂剂也显示出抗纤维化和抗炎活性（图7），可能比单一降脂剂更有潜力发展成为治疗NASH的治疗药物。当将我们的结果与之前的研究进行比较时，必须指出，CPF不仅显示出显著的降脂作用，而且具有抗纤维化和抗炎活性，这可能成为一种有前景的药物。虽然有这些有希望的结果，但是在未来的迭代进一步研究中，CPF在NASH小鼠中抗纤维化和抗炎症的系统机制可能实际上显示出更大的效力。

结论

总之，本研究已使用脂质组学和蛋白质组学研究了调节的脂质相关生物标志物，以及NASH和CPF降脂作用的潜在机制。组织切片染色分析和生物化学表明，补充CPF可以系统地改善脂质代谢，通过降脂、抗炎和抗纤维化作用改善肝脏脂肪变性。通过肝脏脂质组学分析，这些降脂作用与DGs、TGs和Cers水平的下降特别相关，49种脂质被确定为潜在的脂质生物标志物。蛋白质组学分析和PCR也显示CPF抑制肝脏ACC1与降脂作用相关。上述发现表明，脂质稳态的调节可能是NASH中CPF机制的关键途径。CPF通过抑制ACC1预防NASH的详细分子机制需要我们在未来的研究中进一步探索。

原文链接：  

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S175646462200411X?via%3Dihub

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