科研（IF:66.850） |Cell：远交系褐色脂肪蛋白质组的结构定义了代谢生理学的调节因子

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导读

代谢性疾病是人类最常见的疾病之一，而遗传变异是代谢疾病发病的主要决定因素。遗传变异导致蛋白质丰度或功能的改变影响了代谢疾病的发病机制。褐色脂肪组织(Brown adipose tissue；BAT)产热的蛋白因其调节能量消耗(EE)、全身代谢和代谢性疾病的能力而被广泛研究。人体内的BAT分解代谢活性是高度可变的，了解在基因多样性人群中控制BAT功能差异的分子基础可以深入了解代谢性疾病的共同调节因子。然而，几乎所有BAT蛋白功能的机制研究都发生在单个近交系小鼠中，这限制了人们对BAT调节生理活动的可推广机制的理解。本研究中，我们对163只基因定义多样性的远交系小鼠队列中进行了BAT的深度定量蛋白质组学研究，该模型与在人类中发现的基因和表型变异相似。我们利用这种多样性来定义包括10479个蛋白质的BAT蛋白组的功能结构。我们为2578个蛋白质指定了功能，从而能够系统地发现BAT的调控因子。我们还确定了638种蛋白质，它们与对代谢疾病的至少一个参数的保护或敏感性相关。我们利用这些发现揭示了SFXN5、LETMD1和ATP1A2作为BAT产热或肥胖的调节因子，可以提供BAT远交蛋白质组结构(OPABAT)作为了解BAT调节代谢生理的保守机制的资源。

简述

一种质谱学和网络分析方法，利用在远缘繁殖群体中发现的自然遗传、蛋白质组和表型多样性来注释褐色脂肪组织中数千种蛋白质的功能。

要点

1.多样性远交繁殖蛋白质组结构诠释了BAT蛋白的生物学功能

2.合作网络分析揭示了代谢生理学的新调节器

3.QTL分析用于指导特定表型结果的菌株选择

4.发现SFXN5、LETMD1和ATP1A2是BAT生热和肥胖的调节因子

论文ID

原名：Architecture of the outbred brown fat proteome defines regulators of metabolic physiology译名：远交系褐色脂肪蛋白质组的结构定义了代谢生理学的调节因子
期刊：CellIF：66.850发表时间：2022.11通讯作者：Edward T.Chouchani；HaopengXiao
通讯作者单位：哈佛大学

实验设计

实验结果

1.定义DO队列的基因型、表型和BAT蛋白质组
我们的研究队列包括163只全基因型雌性多样性远交系(DO)小鼠。DO队列的遗传多样性远远超过标准的等基因小鼠品系，与人类相似(图1B)。在基础条件下和在热中性(TN)高脂饮食(HFD)喂养8周期间，对该队列进行了与肥胖和BAT功能相关的主要代谢表型分析(图1C)。从所有小鼠肩胛间分离BAT用于基于MS的蛋白质组学分析。小鼠拥有大量的脂肪库，其中包含产热脂肪细胞，有褐色和米色。在位于TN的小鼠中，肩胛骨间的BAT是产热脂肪细胞最强健和均匀的来源，它紧密地概括了相应的人类细胞的产热功能。因此，我们选择肩胛间BAT进行蛋白质组学表征。由于大样本量和肽序列异质性所固有的技术可变性，远交蛋白质组学一直是一个主要的挑战。为了解决这个问题，我们使用了超级串联质谱标签(TMT) 16-plex试剂和目前最先进的蛋白质定量仪器提供的样品复用(图1D)。我们对生成DO小鼠的8个起始组织进行了全蛋白质组消化，以获得一个包含所有基因起始组织共享的肽的数据库，用于肽过滤。为了测试这一策略的稳健性，我们从DO队列中随机选择了13个BAT蛋白质组，在同一TMT系和12个独立的TMT系中进行三次重复测量。我们观察到没有样本聚类归因于TMT批次和低技术可变性。这些结果表明，上述方法可以精确定量BAT蛋白组。使用上述工作流程，我们在整个DO队列中以高置信度定量了10479个蛋白质，其中约70%在每只小鼠中定量。每个TMT plex在BAT中平均量化了约9000个蛋白质。小鼠BAT中的蛋白质组覆盖率比以前的报告高34%-74%(图1E)，定量的低丰度蛋白质多了约10倍(图1F)。与以前的蛋白质组学工作不同，我们在一个远交繁殖队列中量化了蛋白质，这表明了在自然种群范围内产生蛋白质表达变异性的遗传扰动。DO队列中蛋白质丰度的显著变化在等基因队列中不太明显，这使得我们能够推导出共变异来系统地定义共调节蛋白的相互作用并构建OPABAT。图1 测量DO队列中的基因型、表型和蛋白质组(A)协同杂交(CC)和多样性远交(DO)育种方案综述。(B)不同人群单核苷酸多态性(SNPs)比较。(三)OPABAT的实验设计。(D)基于TMT的BAT蛋白定量。(E)与其他研究相比，OPABAT的基因型和蛋白质组覆盖率。(F) OPABAT比以前的报道量化了更多的低丰度蛋白质。
模块1:定义OPABAT的共表达式网络分析尽管许多BAT蛋白已经被广泛研究，但OPABAT中定量的10479个蛋白中的绝大多数并没有明确地注释到特定的复合体或生物学功能。功能蛋白质组学可以通过评估蛋白质的协同调节来注释未被研究的蛋白质。该原理依赖于在异质群体中评估蛋白质丰度的相关性，并已被应用于蛋白质协调功能和蛋白质复合体和通路的稳健识别。本研究利用深度OPABAT蛋白组，基于相关表达系统地注释蛋白质功能。与之前的研究一样，我们计算了每对可能的蛋白质表达谱之间的Pearson相关性，作为蛋白质-蛋白质关联的度量(图2A)。然后将这些关联过滤到<5%的错误发现率(FDR)，得到一个包含160364个显著蛋白质-蛋白质相关性的网络。我们首先通过研究可能导致显著相关性的机制来注释这个体系结构(图2B)。我们将我们的网络叠加到Bioplex和CORUM上，它们包含高置信度的蛋白质物理相互作用和复合物(图2B)。OPABAT网络中共有10773个(6.7%)的边是由已知的物理相互作用解释的，这完全再现了102个CORUM络合物。完全和部分再现的复合体的例子显示在图2C中。许多部分网络可归因于已知的瞬时或组织特异性蛋白复合体，这些复合体在BAT中似乎无法重现。为了进行更广泛的研究，我们还在BioGRID、STRING和MINT中编译了物理交互。总的来说，17499(10.9%)边可以用已知的物理相互作用解释。此外，我们还研究了可以通过共同生物过程中的协同活动来解释的边，这额外注释了49205个边。大多数物理相互作用(79%)也被确定为协调途径，包括代谢途径，如TCA循环(图2D)。总体而言，基于文献证据，OPABAT中41.6%的共作边被注释(图2B)。这表明，在共享蛋白质生物活性的基础上，体外繁殖蛋白质组的共作网络分析产生了一个稳定的网络结构。图2 共变分析识别共作蛋白(A) OPABAT共表达网络。(B)文献证据解释OPABAT中的互作界限。(C) OPABAT中高度再现的CORUM配合物。红节点，再现网络成员；灰色节点，缺失的网络成员。(D) OPABAT重现了TCA循环。(E)确定已知蛋白复合物或通路的共作蛋白。红节点，已知网络成员；蓝色节点是相邻的蛋白质；橙色节点，测试共作的蛋白质；灰色节点，OPABAT中的所有其他蛋白质。(F) CORUM核心复合物和共作蛋白。(G)已建立复合物的典型共作蛋白。红边代表复杂子单元之间的相互作用；橙色边，涉及到共作蛋白的相互作用。(H)已建立的产热调节蛋白的共作蛋白。(I)解偶联蛋白1(UCP1)共作伙伴。红边，有文献证据的共作蛋白；灰色边，文献中没有证据；表，UCP1的前10个共作蛋白。
2.OPABAT注释了BAT蛋白的生物学功能
除了重建数百个已建立的蛋白质网络，我们还确定了93660个之前未描述的相关性。接下来，我们系统地评述了基于蛋白质协同作用的蛋白质生物学功能。通过对共作边的富集程度进行评分，可以确定是否存在与已知复合体或通路的共作蛋白相互作用(图2E)。总的来说，我们在OPABAT中发现了515 ~ 3500个CORUM核心复合物，其中包含1736个新发现的共作蛋白(图2F)。突出的例子包括与蛋白酶体亚基和mTORC1复合体的共作网络成员(图2G)。为了验证我们的结果，我们查询了这些相互作用的实验证据，以支持新发现的共作蛋白和复合体和注释的923个共作事件之间的物理相互作用。在不同的复合物中，共作蛋白的总数差异很大(图2F)。同时，我们还鉴定出2345个与265个已建立的KEGG通路相关的蛋白质。对2578个蛋白质(OPABAT蛋白质组覆盖率的24.6%)的系统测定显示了与已建立的蛋白质网络的共作，为阐明这些靶点的生物学功能提供了明确的理论基础。因此，我们接下来研究了新发现的共作蛋白是否可以作为确定BAT产热功能调节因子的基础。为此，我们检查了在产热过程中具有良好作用的蛋白质的共作伴侣(图2H)。其中研究最广泛的生热蛋白是UCP1，它只在BAT和BGE中表达。UCP1是产热呼吸的主要效应因子，被认为有助于BAT对代谢性疾病的保护活性。UCP1的丰度和活性受到上游的严格调控，但保持UCP1丰度和活性的蛋白质仍保留部分特征。有趣的是，我们的网络分析揭示了84种与UCP1具有显著共作作用的蛋白质，其中只有14种之前与UCP1相关(图2I)。与UCP1相互作用最强的是两个基本不具有特征的蛋白：LETMD1和SFXN5(图2I)。
3.LETMD1是UCP1丰度和BAT产热的调控因子
在BAT中，LETMD1与UCP1高度共作(图3A)。在此基础上，我们探讨了LETMD1在UCP1功能和BAT活性中的作用。我们首先证实了LETMD1亚型1的存在和较高的相对丰度，这推动了与UCP1的相关性。然后我们检测了LETMD1的组织表达，发现它和UCP1一样，在BAT和BGE中有选择性地表达(图3B)。此外，与UCP1一样，LETMD1在BAT中表达是冷诱导的，并且在褐色脂肪细胞中定位于线粒体内膜(图3C-3F)。在此基础上，我们生成了LETMD1敲除小鼠，以探索LETMD1对UCP1可能的调控作用(图S3D)。然而，LETMD1的缺失导致BAT中UCP1蛋白的缺失和BAT的白化(图3G, 3H)。此外，分化褐色脂肪细胞中LETMD1的缺失显著降低了产热能力(图3I)，这与UCP1蛋白的高度选择性丢失(图3J和3K)相一致，独立于其他产热因子或线粒体呼吸链复合体的表达。事实上，缺乏LETMD1的小鼠也表现出严重的BAT依赖性适应性产热能力(图3L-3N)。这些发现与本研究审查期间发表的报告一致，这些报告还说明了线粒体LETMD1在调节BAT产热方面的关键作用。总之，我们的数据确定了LETMD1是BAT中UCP1丰度和适应性产热的调节因子，并展示了如何使用远交BAT蛋白质组的共作网络分析来识别特征较差的蛋白质的生物学作用。图3 OPABAT鉴定LETMD1和SFXN5是依赖于UCP1的BAT产热调控因子(A) LETMD1表达与UCP1高度相关。(B) LETMD1和UCP1在组织中具有相似的线粒体表达谱。SKM，骨骼肌。(C)冷诱导LETMD1和UCP1在BAT中的表达。(D)结构光学显微镜(SIM)显示LETMD1-HA(紫色)线粒体外膜(OMM)标记TOMM20(绿色)和内外膜(IMM) COX4(绿色)。60倍放大。(E) LETMD1-HA荧光信号与COX4共定位，而不与TOM20共定位。(F)胰蛋白酶消化检测UCP1、LETMD1和SFXN5以及TOMM22 (OMM)和GPD2(膜间空间[IMS])。(G) BAT LETMD1在野生型(WT, LETMD^+/+)、杂合子型(HET, LETMD^+/−)和全敲除型(KO, LETMD^−/−)C57BL/6J小鼠中的表达。(H) BAT UCP1在LETMD1 WT, HET和KO小鼠中的表达。N=3。(I) LETMD1敲低(KD)减弱分化褐色脂肪细胞的细胞呼吸作用。OCR，耗氧率；ISO，异丙肾上腺素；oligo，寡霉素；CCCP，羰基氰化物3-氯苯腙；ant/rot，抗霉素类/鱼藤酮。n=10。(J和K) LETMD1 KD特异性降低UCP1丰度。n=3。(L) LETMD^−/−小鼠在暴露于寒冷(4°C)时不能保持体温。WT, n=3；HET，n=4；KO，n=5。(M和N) LETMD^−/−小鼠对CL316, 213注射液的呼吸反应减弱。对照测量在热中性。WT，n=8；HET，n=6；KO，n=5。(O) SFXN5-UCP1丰度相关性。(P) SFXN5 KD减弱了分化褐色脂肪细胞的细胞呼吸作用。OCR，耗氧率；NE，去甲肾上腺素；oligo，寡霉素；CCCP，羰基氰化物3-氯苯腙；ant/rot，抗霉素类/鱼藤酮。n=10。(Q和R) SFXN5 KD不改变UCP1丰度。n=3。(S和T) SFXN5^KD小鼠对冷暴露的呼吸反应减弱。对照，室温。n=6。(U和V)基于MITO-Tag的代谢组学发现，NE处理后SFXN5^KD细胞的线粒体中G3P缺失。WT，n=4；KD，n=6。(W) SFXN5和UCP1是OPABAT中新发现的KEGG甘油磷脂代谢途径的协同蛋白。红色节点和边，已建立通路；橙色节点和边，新的共作蛋白/边。(X) WT和SFXN5^KD成熟褐色脂肪细胞线粒体使用不同燃料源时UCP1依赖的呼吸，计算方法为G3P(或丙酮酸/苹果酸)-GDP的OCR。n=3。数据以平均值±SEM表示。∗p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001。(I, L, M, P, S)双向方差分析检验。(J, K, N, Q, R, T, V，和X)双尾学生T检验。(W)Fisher精确检验。
4.SFXN5支持线粒体甘油-3-磷酸的利用，是UCP1依赖性产热的调节因子
SFXN5是一种对线粒体膜蛋白知之甚少的蛋白，在BAT中的作用尚不清楚。在OPABAT中，SFXN5与UCP1的全蛋白组共作性最高(图3O)，而SFXN1-4与UCP1的相关性不显著。与UCP1和LETMD1一样，SFXN5在BAT中高度表达，其转录本表达具有冷诱导性。此外，我们发现SFXN5的定位仅限于UCP1所在的线粒体内膜(图3F)。这些数据使我们假设，SFXN5调节了BAT中UCP1依赖性的产热作用。为了验证这一点，我们在分化的初级褐色脂肪细胞中敲除了SFXN5，这导致了产热能力的显著降低，而不影响UCP1的丰度(图3P-3R)。小鼠BAT中SFXN5的敲除减弱了暴露于寒冷时全身的产热反应(图3S, 3T)。由于SFXN5是一种抑制产热呼吸而不影响UCP1蛋白水平的线粒体蛋白，我们研究了SFXN5是否调节线粒体代谢过程，这对支持UCP1依赖的产热至关重要。我们在肾上腺素能刺激后，对野生型(WT)和SFXN5^KD分化的初级褐色脂肪细胞应用了一种快速线粒体免疫纯化方法，以识别依赖于SFXN5的线粒体代谢过程(图3U)。分析结果表明，在敲除SFXN5后，线粒体甘油-3-磷酸(G3P)水平显著减少(图3V)。这一观察结果与我们的共作网络分析一致，我们还将SFXN5定义为一种新的甘油磷脂代谢途径的共作蛋白(图2E和3W)，G3P通过该途径代谢。已知G3P支持UCP1介导的产热呼吸，我们的数据表明SFXN5参与了这一过程。为了进一步验证这一点，我们测量了从分化的褐色原代脂肪细胞分离的线粒体的底物利用能力，发现SFXN5的耗尽导致线粒体利用G3P的能力降低，而对丙酮酸连接呼吸没有显著影响(图3X)。总之，我们的数据表明，SFXN5通过支持G3P的线粒体代谢利用来调节UCP1依赖的产热呼吸。该验证为OPABAT如何用于生成可测试的假设以确定孤儿蛋白的生物学作用提供了另一个演示。模块2：绘制DO队列的表型变异我们量化了在基础条件下和高脂HFD喂养8周期间与肥胖和BAT功能相关的33个主要代谢参数(图4A)。我们发现DO队列在许多与代谢性疾病相关的主要生理参数上表现出显著的表型异质性(图4A)。一个显著的例子是对HFD的肥胖反应，其中一些小鼠在HFD干预后变得严重肥胖，而另一些小鼠表现出显著的肥胖抵抗(图4A)。这种变异性大大超过HFD干预后相似年龄组C57BL/6J小鼠观察到的变异性。有趣的是，在整个队列中，某些表型参数之间的相关性比其他参数更强。我们评估了OPABAT表型变异反映在人类群体中的程度。我们检查了从1281名非吸烟患者(男性223例，女性1058例)中收集的表型数据，这些患者被证实存在BAT且没有4期癌症。我们发现男性和女性在BAT活性和大多数代谢表型上表现出相似程度的变异。此外，OPABAT小鼠的表型变异与人类群体中的表型变异相似，表明DO模型具有足够的异质性，可以衍生共变异，用于表型输出的分子驱动分析。图4 表型变异的遗传基础(A) DO队列中代谢参数的可变性。(B) QTL定位和小鼠品系选择工作流程。(C) LOD评分为>6的表型QTL(存在QTL的可能性是不存在QTL的10⁶倍)。(D) VO₂寒冷/白天QTL的曼哈顿图。(E)初始菌株对VO₂寒冷/白天的等位基因贡献(QTL-染色体1787.49 Mbp)。(F)低(蓝色)或高(红色)VO₂寒冷/白天初始菌株和CC株的选择。(G)体脂率QTL的曼哈顿图。(H)体脂率的等位基因贡献(QTL-染色体1163.08 Mbp)。(I)低(蓝色)或高(红色)体脂百分比的初始株和CC株的选择。(J) UCP1 pQTL的曼哈顿图。(K)初始株等位基因对UCP1蛋白丰度的贡献。(QTL- 11号染色体，89.47 Mbp)。由10000次迭代排列试验得到的P值。(L)初始株和CC株的低(蓝色)或高(红色)UCP1蛋白表达的选择。
5.OPABAT暗示小鼠品系选择
通过结合OPABAT的遗传、蛋白质组学和表型，我们生成了远交小鼠表型多样性的分子基础。我们对33种代谢表型进行了QTL定位(图4B和4C)。通过对比值(LOD)>6确定初始株对29个QTL等位基因的贡献，我们生成了一个资源来指导168个市售协同杂交(CC)和初始小鼠株的选择，以研究特定的BAT依赖表型输出。根据小鼠单倍型在给定QTL上的基因型概率，将其分为8个始祖纯合等位基因状态之一。例如，我们对许多菌株的静息e相关参数(耗氧量[VO₂]寒冷/白天；图4D-F)。我们还调查了最可能表现出肥胖易感性或抵抗性的细胞株(图4G)。我们发现，NZO/HlLtJ(被称为新西兰肥胖)初始等位基因效应对肥胖易感性的贡献最大，而129S1/SvImJ是最强的负性贡献(图4H和4I)。CC001/UncJ、CC005/TauUncJ、CC009/UncJ、CC025/GeniUncJ、CC043/GeniUncJ和CC068/TauUncJ细胞株在该位置是纯合子的NZO/HlLtJ等位基因，与NZO/HlLtJ初始株一起是肥胖易感性模型的最佳候选菌株(图4I)。我们扩展了这一分析，以确定可以表达BAT中感兴趣的特定蛋白质的小鼠品系。为此，我们绘制了BAT蛋白QTLs (pQTLs)图谱，在全基因组显著性水平p<0.05上识别出2046个pQTLs(1390个本地对656个远程)。例如，UCP1和LETMD1的远端pQTL被映射到第11号染色体的89.47 Mb位置。在此基础上，我们确定了初始株的等位基因对UCP1表达的影响(图4J-L)。NZO/HlLtJ初始等位基因效应对UCP1表达的负面影响最大(图4K-L)。该等位基因纯合的CC菌株为CC003/UncJ、CC005/TauUncJ、CC011/UncJ、CC042/GeniUncJ和CC068/TauUncJ(图4L)。这些菌株也是BAT中表达低水平LETMD1的首选菌株。总的来说，我们确定了42个市售菌株，它们最有可能表现出特定的代谢表型或蛋白质表达水平。模块3：远交小鼠代谢疾病的BAT蛋白决定因素我们接下来利用OPABAT来识别代谢疾病的蛋白质调节因子。我们确定了蛋白质表达和表型数据之间的相关性，发现数百种蛋白质与至少一个表型参数显著相关(图5A)。尽管有些蛋白质与多种表型具有共同的相关性，但许多蛋白质是每种表型所独有的(图5B)。这些发现表明，不同的蛋白质通路可以调节BAT功能的特定特征，例如，区分BAT调节冷暴露反应和抵抗肥胖的能力。我们的分析确定了几个已知在BAT功能、肥胖和代谢性疾病中起作用的蛋白质生理相关蛋白(图5C-5K)。例如，在HFD下，瘦素和NPR3两种蛋白质与肥胖的相关性最强。瘦素是一种被广泛研究的激素，可以调节食物摄入量和体重。肥胖受试者的循环瘦素和瘦素抵抗水平较高。事实上，我们发现BAT中的瘦素与DO人群的体重、脂肪量和体脂百分比呈正相关(图5C、5D、5F和5H)。另一个顶级相关蛋白，NPR3，是利钠肽(NPs)的清除受体。NPs刺激脂肪细胞的脂肪分解，促进BAT和BGE的产热。在BAT中，NPR3通过NPR1拮抗NP信号抑制产热。事实上，脂肪组织特异性敲除NPR3的小鼠表现出更高的EE，并对HFD诱导的肥胖具有抵抗性。根据我们的研究结果，BAT NPR3表达是近亲繁殖群体肥胖的积极驱动因素(图5C, 5D, 5F和5I)。在近交系小鼠中，BAT产热效应因子和调节蛋白的丰度被广泛用于评估产热脂肪细胞活性和BAT驱动的对代谢性疾病的保护作用。然而，我们发现远交繁殖的人群中，这些因素中的大多数的丰度与任何代谢疾病参数都不相关(图5C-5G, 5K和5L)。与主流观点相反，这些蛋白质丰度的升高似乎不足以引起BAT对代谢性疾病参数的保护。相反，我们的研究结果表明，在蛋白表达水平上，BAT的生理输出是由BAT蛋白组结构的其他组成部分决定的，这可能应该优先考虑利用该组织的治疗活性。其中最突出的例子是ATP1A2, Na⁺/K⁺转运ATP酶亚基α2(图5J)。在DO队列中，BAT中ATP1A2的丰度是与HFD中体脂增加百分比最强的正相关因子。使用基于Lasso方法的正交机器学习方法证实了这一结果。有趣的是，ATP1A2丰度也表现出与VO₂、二氧化碳输出(VCO₂)和EE的中度负相关，进一步表明ATP1A2在BAT产热和BAT介导的肥胖保护中具有拮抗作用。在此基础上，我们对ATP1A2进行了机理表征会如下文所述。最后，我们研究了细胞群异质性在驱动表型输出方面的贡献。我们使用一种算法对我们的蛋白质组学数据进行了数字细胞术，以逆卷积BAT中的细胞群。我们发现，在DO队列中褐色脂肪细胞含量与脂肪质量、体重和体脂百分比呈负相关，这表明褐色脂肪细胞对全身EE的主要代谢贡献。图5 全身代谢生理学中的BAT蛋白决定因素(A)各参数的显著正、负蛋白质相关因子数量。(B)代谢参数间蛋白质相关因子的Jaccard相似度。(C-G)肥胖参数的OPABAT蛋白相关物。(H) LEP丰度与体脂率的相关性。(I) NPR3丰度与体脂率的相关性。(J) ATP1A2丰度与体脂增加百分比的相关性。(K) UCP1丰度与脂肪量的相关性。(L)所有代谢表型与顶级蛋白相关因子或主要已建立的BAT产热调控因子之间的相关性。
6.ATP1A2抑制褐色脂肪组织的能量消耗
Na⁺/K⁺转运ATP酶由α、β和γ亚基组成。α亚基的组成来源于ATP1A1或ATP1A2，而ATP1A2的表达是组织特异性的。在心肌细胞中，ATP1A2丰度的增加导致质膜电位的超极化，而在培养的原代星形胶质细胞中，ATP1A2丰度与Ca²⁺内流呈负相关。质膜的去极化对于电压依赖性钙通道(VDCCs)的Ca²⁺输入至关重要，这是对肾上腺受体激动的上游反应。众所周知，Ca²⁺内流可触发cAMP介导的通路，激活褐色脂肪细胞中的脂肪分解和产热。基于快速Ca²⁺内流在调节生热作用中的作用，我们假设ATP1A2丰度的升高可以通过拮抗钙流入依赖性的生热效应激活来抑制褐色脂肪细胞的EE(图6A)。为了测试这个模型，我们首先检查了基因操纵对小鼠初级褐色脂肪细胞中ATP1A2丰度的影响(图6B)。ATP1A2的过表达足以在肾上腺素能刺激时显著抑制Ca²⁺流入褐色脂肪细胞(图6C)。相反，ATP1A2的siRNA干扰使脂肪细胞对NE依赖的Ca²⁺内流增敏(图6D)。我们接下来检查了下游的产热信号。通过定量磷酸化蛋白组学，我们发现过表达ATP1A2显著降低了肾上腺素能刺激后PKA靶点的磷酸化(图6E)。此外，通过ATP1A2的升高，NE依赖性的脂肪分解和产热呼吸的升高被显著抑制(图6F和6G)。综上所述，我们的数据表明，在褐色脂肪细胞中，ATP1A2的丰度升高可以拮抗肾上腺受体介导的产热反应。接下来我们在8周龄脂联素重组酶(Cre) C57BL/6J小鼠的成熟BAT中过表达ATP1A2。我们通过将腺相关病毒(AAV)的CRES驱动的ATP1A2表达局部传递到BAT，并监测8周高脂饮食下小鼠的致胖反应(图6H-6J)。我们发现，在HFD干预后，与GFPOE对照组相比，BAT中ATP1A2的升高导致体脂百分比显著升高(图6K)，而在食物摄入量或变瘦质量方面没有差异(图6L和6M)。体脂增加百分比的差异比其他脂肪测量值更显著(图6K)。对特定脂肪库的分析表明，这种差异是由于ATP1A2^OE小鼠附睾脂肪量相对增加所致(图6N)。接下来，我们在C57BL/6J小鼠的BAT中干扰ATP1A2(图6O)，这降低了HFD喂养下BAT的脂质含量和白色脂肪减弱(图6P-R)。这与较低的体脂和皮下脂肪组织(SAT)质量百分比有关，没有食物摄入量或变瘦质量的差异。此外，BAT中ATP1A2的敲除导致产热过程中PKA信号下游的脂肪酸氧化和氧化磷酸化关键效应因子的表达升高。综上所述，这些结果表明，在肥胖环境中，ATP1A2在BAT中的表达调控足以动态调节BAT功能和肥胖。这些数据举例说明了OPABAT如何被用于识别BAT介导的代谢疾病保护的新调控因子。图6 ATP1A2抑制BAT能量消耗(A) ATP1A2作为BAT能量消耗负调控因子的模型。(B)腺病毒或siRNA产生ATP1A2过表达(ATP1A2^OE)和ATP1A2敲除(ATP1A2^KD)褐色脂肪细胞。n=3。(C)对照组和ATP1A2^OE分化的褐色脂肪细胞的平均Fluo-4强度迹线(归一化到0 min时的强度)。强度绘制为相对于基线的变化F/F₀。N=209个细胞。(D)对照组和ATP1A2^KD分化的褐色脂肪细胞的平均Fluo-4强度迹线(归一化到0 min时的强度)。强度绘制为相对于基线的变化F/F₀。n=209个细胞。(E)与GFP对照相比，通过磷酸化蛋白质组学测定ATP1A2^OE分化褐色脂肪细胞中PKA底物磷酸化下调。n=4。(F) ATP1A2 OE减弱了分化褐色脂肪细胞的脂解作用。n=4。(G) ATP1A2 OE可减弱分化褐色脂肪细胞的细胞呼吸作用。OCR，耗氧率；NE，去甲肾上腺素；oligo，寡霉素；DNP，2,4-二硝基酚；ant/cot，抗霉素类/鱼藤酮。n=4。(H)对照组和BAT特异性ATP1A2^OE小鼠在HFD和TN作用下的体成分分析。(I)注射后2周BAT、SAT和附睾脂肪(epi)中ATP1A2 OE的qPCR分析。n=8。(J) HFD开始时ATP1A2^KD和对照组的体脂百分比。n=7。(K) HFD后ATP1A2^OE和对照组体脂率增加。n=7。(L) HFD下ATP1A2^OE和对照组的食物摄入量。n=7。(M) HFD下ATP1A2^OE和对照组变瘦的质量。n=7。(N) ATP1A2^OE和对照组HFD后epi质量。n=7。(O) BAT、SAT和epi中ATP1A2 ^KD的qPCR分析。n=4。(P) HFD后ATP1A2^KD和对照组的BAT质量。n=15。(Q) HFD后BAT组织外观。(R) BAT组织及H&E染色。ATP1A2^KD BAT中存在许多小脂滴，且白色较少。n=3。数据以平均值±SEM表示。* p<0.05，* * p<0.01，* * * p<0.001。(B, E，折叠变化，I-K，和M-P)双尾学生t检验；(E)Fisher精确检验；(C, D, F, G, L)双向方差分析检验。
模块4:在人类中总结OPABAT蛋白表型相关因子接下来，我们探讨了OPABAT蛋白表型相关因子在人类中的相关程度。首先，我们检查了微阵列数据，比较了10名人类患者颈BAT和浅表或皮下SAT中的转录本丰度。我们发现OPABAT表型相关蛋白的转录本在人BAT中比SAT中高表达(图7A)。接下来，我们研究了OPABAT中观察到的蛋白质表型相关性是否在人类中重现。为此，我们从20个去识别的人类队列中收集了表型和锁骨上脂肪组织(SCVAT)转录数据。SCVAT是人体内BAT的主要位点。该队列在热中性或室温条件下测量了39个定量表型参数(图7B)，同时对SCVAT活检进行RNA-seq分析。对于我们在OPABAT中测量的每个参数，我们分析了有多少小鼠蛋白质相关因子被概括为人类转录表型相关因子(图7C)。在8%到39%的蛋白质相关因子被概括为人类肥胖表型(图7D和7E)。例如，174个OPABAT体重相关因子被概括为人体质量指数(BMI)相关因子(图7F)。这些数据表明，尽管蛋白质和mRNA表达之间存在潜在的不一致，但大部分OPABAT表型相关因子在人类人群中被重现。我们接下来研究了人类的SAT，它显示了诱导产热的能力(图7G)。我们分析了43人SAT队列中表型和转录本之间的相关性。OPABAT中22%到30%的肥胖蛋白相关因子被作为人类SAT中的表型转录本相关因子(图7H-I)，而BMI是人类表型中OPABAT相关因子最多的人群(图7J)。总之，这些数据表明，在DO小鼠中确定的蛋白质表型相关因子在人类中重现。最后，我们探讨了代谢表型的OPABAT蛋白相关因子与人类疾病的关系。我们将这些靶点映射到DisGeNET上，这是一个已建立的人类疾病相关基因的综合集合。我们发现OPABAT相关因子在人类疾病网络上的高度显著映射，如肥胖、糖尿病和代谢疾病相关的肝脏病理。这些蛋白质中的许多被概括为人类表型相关因子。尽管BAT代谢与广泛的疾病有关，这些联系背后的分子靶标还没有很好地理解。我们在这里的分析揭示了BAT中的蛋白质，可以优先分析通过调节BAT功能与人类代谢性疾病的相关性。图7 OPABAT代谢生理相关因子的人体相关性(A)人类中BAT表达高于SAT的转录本中OPABAT相关物丰富。n=10。(B) 20名女性患者队列中代谢参数的变异性。(C)比较OPABAT蛋白表型相关物与人类SCVAT转录表型相关物。(D)总结了OPABAT和人类SCVAT之间的肥胖相关因子。(E)人体SCVAT中重复出现的肥胖相关因子的数量和百分比。(F)体重的OPABAT相关因子被概括为人体体重指数的SCVAT相关因子。(G)比较OPABAT蛋白表型相关物与人类SAT转录表型相关物。(H)总结OPABAT和人类SAT之间的肥胖相关因子。(I)在人SAT中被再现的肥胖相关因子的数量和百分比。(J)体重的OPABAT相关因子与BMI的人类SAT相关因子相似。* p<0.05，* * p<0.01，* * * p<0.001。(E, F, I, J)排列检验。(A) (F和J富集)Fisher精确检验。

结论

OPABAT代表了小鼠远交BAT蛋白质组的最深层定量图谱。我们利用该模型的异质性进行共变分析，以研究BAT功能和代谢生理的遗传和蛋白质组决定因素。我们利用这些结果发现SFXN5、LETMD1和ATP1A2作为BAT产热和肥胖的调节因子。总之，这项工作证明了深层近亲繁殖蛋白质组学如何有助于发现未被研究的蛋白质的生物活性。我们设想OPABAT中的四个模块将作为刺激假设驱动的研究的基础，以调查代谢疾病中翻译相关的BAT蛋白。

研究的局限性

OPABAT资源有几个限制。由于雄性远交系小鼠的群体居住和代谢评估困难，因此研究队列由雌性小鼠组成。尽管我们在协变分析中表明雄性和雌性种群具有相似程度的表型变异，并且我们验证的生物靶标LETMD1、SFXN5和ATP1A2在雄性小鼠中是通用的，但我们无法对识别的所有蛋白质靶标进行性别间的系统概化评估。此外，远亲繁殖的群体必须基于每个个体的独特性。因此，我们无法在这项工作的干预前或干预后的研究设计中进行侵入性蛋白质测量，这可能额外揭示蛋白质丰度和表型之间的因果关系。

原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36334589/

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