科研 |吉大&中国中医科学院：新分析策略可提高人参蛋白质组学表征性能（国人佳作）
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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读人参是一种珍贵而古老的药用植物。其基因组测序的完成为蛋白质组和肽组的研究奠定了基础。然而，人参中次级代谢产物的高丰度降低了质谱法中蛋白质和肽的识别效率。在本研究中，我们进行了强阳离子交换预处理以消除杂质的干扰。基于蛋白水解肽和代谢产物的电荷分离，质谱检测的灵敏度大大提高。预处理后，我们从根和茎叶提取物中鉴定出2322和2685个蛋白质。此外，基于该优化策略分析人参肽组，其中我们分别从根和茎叶提取物中鉴定出970和653个内源性肽。蛋白质和内源性肽的功能分析为人参的生物活性、代谢过程和人参皂苷生物合成途径提供了有价值的信息。
亮点：1. 通过强阳离子交换预处理，改进了质谱鉴定；2. 对人参进行了蛋白质组学和肽组学鉴定；3. 对人参的根和茎叶进行了比较分析。论文ID
原名：Improved performance of proteomic characterization for Panax ginseng by strong cation exchange extraction and liquid chromatography-mass spectrometry analysis译名：强阳离子交换萃取和液相色谱-质谱分析提高了人参蛋白质组学表征的性能期刊：Journal of Chromatography AIF：4.601发表时间：2022.12通讯作者：胡良海 & 徐江通讯作者单位：吉林大学生命科学学院 & 中国中医科学院中药研究所
实验设计
实验结果
植物中的叶绿素和次级代谢产物会干扰质谱的检测。人参样品制备方法对于去除样品杂质、促进后续处理以及提高蛋白质组研究的检测灵敏度非常重要。在此，我们开发了一种分析人参蛋白质和肽组成的系统策略。如图1所示，人参的蛋白质首先用GdnHCl提取，茎叶提取物的蛋白质在用胰蛋白酶进行蛋白水解之前通过甲醇-氯仿沉淀进一步纯化。对于内源性肽，干扰会高得多，因为小分子更易溶于含1%（v/v）三氟乙酸(TFA)的50%乙腈(CAN)的提取缓冲液中。在进行蛋白质组学分析之前，所有肽都用SCX-SPE cartridge进一步纯化，以去除干扰杂质，有助于LC-MS/MS鉴定。我们选择极性MC30-SP SCX微珠作为固相萃取的填料材料，因为极性MC离子交换填料的基质为亲水性聚甲基丙烯酸酯，具有良好的物理和化学稳定性。为了避免对生物样品可能的非特异性吸附，Polar MC包装材料的表面与磺酸基团键合，这种特殊的改性使其具有高度的亲水性。
1. 人参的蛋白质组学特征
胰蛋白酶作为一种内肽酶，可以切断蛋白质链中赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧。每个被胰蛋白酶剪切的肽片段将在C端具有带正电荷的Lys/Arg残基。由于肽的N端带正电荷，因此在低pH（pH=2.7）条件下，每个肽将具有至少两个正电荷。如果蛋白质没有被完全消化或肽含有多个His残基，它将具有更高的正电荷。酸性条件下的SCX-SPE色谱可能能够基于电荷状态将肽与其他中性分子分离。在装带过程中，这些带两个以上正电荷的肽在低pH下更牢固地保留在SCX-SPE柱上。用于质谱分析的人参蛋白质提取物的预处理需要蛋白质变性、酶水解、脱盐和冷冻干燥。我们将消化的肽进行SCX-SPE处理。相反，很少有代谢产物带正电荷，并且会从SCX-SPE柱上洗掉。
在此基础上，我们使用优化的人参茎叶和根蛋白提取方法，在质谱检测之前对酶肽进行SCX-SPE处理。通过蛋白质组学分析，我们从人参根和茎叶提取物中鉴定的蛋白质总数分别为2322和2685（图2）。相反，在未经SCX-SPE预处理的情况下，我们仅从人参根和茎叶中鉴定出929和1366种蛋白质。我们还可以从人参根和茎叶提取物的总离子色谱图（TIC）中清楚地看到有或没有SCX-SPE处理的差异（图3）。在整个时间窗内，特别是在50分钟后，有更多的疏水分子被洗脱出来。这些非肽代谢物将占用质谱分析时间，并大大减少蛋白质鉴定。SCX-SPE处理后的样品在流动相成分较强时没有明显的干扰色谱峰，因为SCX-SPE处理可以很好地去除样品中的其他杂质。然后，我们用相同的提取操作对根和茎叶的三批蛋白质提取物进行了质谱分析，其中一致的TIC显示出良好的重复性（图S1）。
根和茎叶提取物中三重蛋白质组鉴定的热图提供了无标记定量分析（图4A）。通过观察上述树形图的聚类分析，人参根和茎叶中基因的总体表达模式不同，但三组平行提取物具有良好的重复性。对于根提取物，有两种高度表达的蛋白质。一种是人参主要蛋白（GMP），其主要生物学功能是为主根储存营养。GMP的表达取决于培养条件和环境。它在人参的快速生长期（1-3年）积累，在缓慢生长期（>5年）或恶劣环境下耗尽。这表明它可能是人参生存所必需的营养储存蛋白。另一种是热休克70kDa蛋白（Hsp70），这是一种细胞保护蛋白，主要作用于人参的胁迫应答。Hsp70在正常细胞中以低水平表达，而高温或其他有害胁迫会在很短的时间内显著增加，从而增强人参的生物胁迫能力。相反，茎叶中的蛋白质表达主要与光合作用有关。ATP合成酶参与氧化磷酸化和光合磷酸化过程，通过反应中质子跨膜转运过程中产生的电化学梯度催化ATP的合成。甘油醛3-磷酸脱氢酶参与糖酵解途径，并催化3-磷酸甘油醛的氧化，使其脱氢生成1,3-二磷酸甘油酸。二磷酸核糖羧化酶/加氧酶起着将空气中的二氧化碳固定成有机化合物的作用。过氧化氢酶主要水解组织中的过氧化氢以保护细胞免受毒性作用，丝氨酸羟甲基转移酶在叶酸代谢过程中催化甘氨酸和l-丝氨酸的相互转化。
在平行提取物蛋白质覆盖率的Venn图（图4B，4C）中，至少两个平行样品中鉴定出根和茎叶提取物中超过85%的总蛋白质，表明提取物具有良好的稳定性。通过绘制根和茎叶的比较总蛋白质覆盖率（图S2），共有2055种共享蛋白质，分别占根和茎叶中总鉴定蛋白质的88.5%和76.5%。可以发现，质谱法鉴定的蛋白质存在高度重叠，只有少数蛋白质对根和茎叶具有特异性，表明蛋白质表达的规律性。此外，我们还鉴定了与人参皂苷生物合成相关的蛋白质，包括甲羟戊酸（MVA）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸化（MEP）途径蛋白、细胞色素P450和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移（UGT）酶。
我们进一步探索了根和茎叶中共享蛋白的功能，并从生物学过程、细胞成分和分子功能方面用基因本体（GO）对它们进行了注释。在GO注释中确定的17个生物过程中，前两个富集的蛋白质类别是代谢过程（26.09%）和细胞过程（21.36%）。代谢过程涉及核苷、肽、蛋白质、酰胺和含氧酸等有机化合物的合成和分解。细胞过程的共享蛋白参与维持组织和细胞的正常生长状态。参与分子功能的重叠蛋白包括催化活性（47.91%）和结合（36.25%）。氧化还原酶是催化电子转移的酶，参与不同的代谢过程，如信号转导、生理调节和运输功能。结合的蛋白质可以与包括蛋白质在内的分子形成相互作用。就细胞成分而言，这些蛋白质主要以维持细胞基本生物学功能（如定位、调节、稳态、应激反应和蛋白质折叠）的细胞内和细胞质部分的形式存在。
2. 人参内源肽的肽组学分析
我们交叉比较了根和茎叶提取物中鉴定的总内源性肽及其前体蛋白，Venn图结果如图5所示。与蛋白质水平相比，内源性肽表达显著不同。首先，鉴定的肽和前体蛋白具有非常低的重叠，其中我们在根提取物中鉴定了970个肽和228个前体蛋白，在茎叶提取物中鉴定出653个肽和219个前体蛋白质。然而，只有126种肽和75种蛋白质被根和茎叶共享。我们假设这是由人参根和茎叶中水解酶的不同分布引起的。由于内源性肽是通过体内蛋白质的酶切产生的，因此在肽和前体蛋白的鉴定结果中根茎之间的巨大差异也可以反映人参中不同组织蛋白酶的分布和活性的差异。内源性肽平行样品的无标记热图如图S4所示。通过观察上述树状图中每一列的聚类分析，可以看出两个实验组中基因的总体表达模式截然不同。同一实验组的三个样品的表达模式一致，提取物的鉴定结果在前体蛋白水平上具有良好的平行性，这证明了根组和茎叶组的提取物是可重复的。我们总结了鉴定结果中内源性肽的分子量，如图S5所示。结果表明，根和茎叶提取物中肽的分子量分布趋势主要分布在1000-3000Da的分子量范围内。
我们进一步分析了内源性肽的剪切位点分布，获得的四个剪切位点的结果如图6所示。在根和茎叶提取物中，赖氨酸（K）是所鉴定肽的C端氨基酸的最重要剪切位点，其次是精氨酸（R）和组氨酸（H）。根和茎叶提取物中前肽C端氨基酸的剪切位点主要为丙氨酸(A)，其次为根提取物中的赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)和亮氨酸(L)，茎叶提取物中的亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)。所鉴定肽C末端剪切位点的分布与先前肽的不同。这是因为内源性肽的产生与蛋白酶的类型密切相关。人参根和茎叶中内源性肽的剪切位点也不同，这表明人参中分布有多种类型的剪切酶，它们在不同的组织和位点中起作用。将蛋白酶的分布与内源性多肽在不同位点的剪切模式相结合，有助于更好地了解内源性多肽的产生以及蛋白酶在生物体内的功能。
我们对内源性肽前体蛋白进行了功能研究。根和茎叶提取物中的前10种蛋白质根据前体蛋白质的肽谱匹配（PSMs）的数量和鉴定肽的数量进行筛选。高丰度蛋白质的名称和相应的分子功能如表S1和表S2所示。结果表明，脱氢蛋白是人参中的一种内源性肽前体蛋白。人参根提取物中的高丰度蛋白质中有5种脱氢蛋白，茎叶提取物中有3种脱氢蛋白。脱水蛋白在植物中普遍存在，是一种亲水性强、热稳定性高的蛋白质。当植物暴露于非生物胁迫条件（如干旱、高盐和寒冷）时，外部环境会导致植物中细胞可利用的自由水量减少。此时，脱水蛋白在植物中高度表达，可以稳定核酸、细胞膜和许多生物大分子等重要结构，避免脱水对细胞造成损害。因此，脱水蛋白是植物抗病过程中的关键蛋白。
核糖核酸酶T2家族（RNase T2）蛋白也在人参根的内源性肽提取物中高度表达（表S2）。RNase T2蛋白是内核糖核酸酶的亚类，广泛存在于动物、植物、细菌和病毒的基因组中，具有进化保护性。有趣的是，除了去除核酸和降解RNA外，RNase T2蛋白还可以充当细胞外或细胞内细胞毒素，并调节宿主的免疫反应。植物中的RNase T2蛋白可以参与胁迫抗性。RNase T2基因的转录表达受到低温、高盐胁迫和缺氧胁迫等非生物胁迫的影响，也受到植物衰老、缺磷和损伤的诱导。此外，根提取物中丰富的蛋白质还包括组蛋白H2B，但与脱水蛋白和RNase T2蛋白相比，PSM的数量显著减少。
茎叶丰度蛋白中PSM的数量低于根提取物中的PSM，并且除脱水蛋白外，PSM的类型和功能更加复杂。其中，超氧化物歧化酶在体内氧化和抗氧化的平衡中起着至关重要的作用，它与许多疾病的发生和发展密不可分。过氧化氢酶快速处理体内产生的过氧化氢，以保护身体免受中毒。其余的大多用作功能酶或功能蛋白，以作用于相应的代谢反应，如光系统I反应中心亚基II、S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶和丝氨酸蛋白水解酶。根提取物中蛋白质的高丰度主要与植物的胁迫和抗性有关，这与活性内源性肽在植物中的主要作用一致。然而，茎叶中一些与内源肽相对应的高丰度蛋白质在各种生物代谢过程中充当催化酶，需要进一步研究。此外，茎叶筛选出的蛋白质中PSM的数量通常很低，并且蛋白质之间的差异很小。因此，提取和纯化后残留在样品中的干扰蛋白也可能影响鉴定结果。
通过进一步分析所识别的多肽，我们可以观察到一个蛋白质的许多多肽来自同一区域，这也在人参多肽分析中观察到。梯形肽片段的产生不是随机的。不同部位的酶根据其规则剪切蛋白质。如表S1所示，根中的45个肽来自核糖核酸酶T2家族蛋白（PG12257）。这种蛋白质的分子功能是抵抗免疫胁迫反应，如干旱和疾病，并改变宿主细胞的新陈代谢。然而，45个肽仅对应于蛋白质序列中的6个片段。从根提取物中鉴定的核糖核酸酶T2家族蛋白(PG12257)的6个阶梯的位置在图7A中用水平线标记。图7B显示了一个选定梯形肽片段的序列，其他五个如图S6所示。因为许多肽是从蛋白质序列的同一片段中衍生出来的，它们被称为梯形肽片段。梯形肽片段是通过酶催化产生的，在酶催化下，梯形肽片段逐步切割蛋白质序列的N或C端氨基酸，形成不同长度的肽序列。我们进一步分析了剪切位点的分布。天门冬氨酸（N）是前肽的C端氨基酸的最容易被剪切的位点，而组氨酸（H）占据所鉴定肽的C末端氨基酸的切割位点。假设高分子量多肽是由其前体蛋白的内源性蛋白水解裂解产生的，然后其他酶如氨基肽酶和羧肽酶外切酶进一步裂解高分子量多肽产生低分子量多肽。对肽剪切位点的分析表明，肽的剪切是规则的，这可能反映了体内蛋白酶的活性和分布，代表了组织的生物状态，并为生物标志物的发现提供了新的来源。
结论
强阳离子交换处理和反相色谱相结合可以去除干扰杂质，提高LC-MS/MS鉴定肽的效率。对人参根和茎叶进行了定量蛋白质组学研究。共享和特定蛋白质的生物学功能和代谢途径反映了它们的生物学功能。内源性肽组分析表明，组织中存在丰富多样的蛋白酶被酶解后，剪切位点氨基酸残基分布，为后续的人参多组学研究提供了依据。开发的策略也有望应用于其他草药的蛋白质组学研究，以获得广泛应用。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967322008834?via%3Dihub
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