科研（IF:17.694） |复旦&国家蛋白质科学中心：小鼠组织中巨噬细胞的整合蛋白质组学和转录组学景观（国人佳作）
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导读巨噬细胞参与组织内稳态，对先天免疫反应至关重要，不同组织中不同的巨噬细胞亚群表现出多种基因表达模式和生物过程。虽然已经报道了组织特异性巨噬细胞表观基因组和转录组特征，但不同巨噬细胞亚群的蛋白质组特征仍然很差。在这里，我们使用质谱和RNA测序分别评估了来自七个小鼠组织、骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）和细胞系RAW264.7的蛋白质组学和转录组学模式。结果显示了组织固有的巨噬细胞和招募的巨噬细胞之间不同的蛋白质组景观和蛋白质拷贝数。构建分级调控网络发现巨噬细胞的细胞类型特异性转录因子作为指示单个巨噬细胞亚群的组织和功能特性的中枢。最后，白介素18（Il18）被证实在区分肺和肝中组织固有和招募的巨噬细胞之间的分子特征和细胞功能特征方面至关重要。总之，这些存储的数据集和我们公开的蛋白质组服务器(http://macrophage.mouseprotein.cn) 整合所有信息将为未来小鼠巨噬细胞的功能和机制研究提供宝贵的资源。
论文ID
原名：Integrated proteomic and transcriptomic landscape of macrophages in mouse tissues译名：小鼠组织中巨噬细胞的整合蛋白质组学和转录组学景观
期刊：Nature CommunicationsIF：17.694发表时间：2022.11通讯作者：丁琛、贺福初、wenjun Yang通讯作者单位：复旦大学、国家蛋白质科学中心、上海交通大学附属新华医院、中国医学科学院
实验设计
实验结果
1. 十个原代巨噬细胞亚群、BMDM和RAW264.7细胞的蛋白质组和转录组图谱
为了探索组织固有的巨噬细胞中蛋白质表达谱的特征，我们分离了七个主要组织固有巨噬细胞亚群，以及C57BL/6N小鼠（8-12周龄）的小肠和大肠巨噬细胞群。为了确定组织固有巨噬细胞和招募的巨噬细胞之间的差异，我们同时分离了肺、肝和脾中的三个组织招募巨噬细胞亚群。根据已发表的文献，共有13个表面标记物用于细胞分类。通过流式细胞术反向测试获得的证据表明巨噬细胞亚群的平均纯度为98%。然而，值得注意的是，在组织消化过程中，由于巨噬细胞的吞噬活性和巨噬细胞残余物对其他细胞的作用等因素可能造成的污染是不可避免的，研究人员还收集了细胞系RAW264.7和BMDM，因为这些亚群虽然保持在培养中，但被广泛用作永生细胞系或巨噬细胞生物学模型（图1a）。
对于每个巨噬细胞亚群，使用高分辨率质谱仪对相同数量的细胞进行LC-MS/MS分析，之后对细胞裂解物进行胰蛋白酶消化，并通过高pH反相液相色谱（RPLC）将所得肽分级为六个部分。使用Firmiana平台处理原始文件，基于Mascot搜索引擎对NCBI鼠Refseq蛋白质数据库进行蛋白质鉴定和定量。选择具有1%FDR和Mascot离子得分大于20的肽用于蛋白质鉴定。然后，选择具有1%FDR的蛋白质用于进一步分析。用肽特征的曲线下面积（AUC）量化所有鉴定的肽。基于强度的绝对定量（iBAQ）算法等方法用于蛋白质定量和蛋白质拷贝数计算。
研究人员共鉴定了12205种蛋白质，在每一个重复中鉴定了7000多种蛋白质，在每个巨噬细胞亚群中平均发现了8000种蛋白质（图1b）。每个巨噬细胞亚群的三个重复中识别的蛋白质显示出高度重叠，生物重复的平均Pearson相关系数r大于0.9，并且发现了一些对巨噬细胞发育至关重要或用作身份标记的蛋白质。
为了比较蛋白质和转录物水平上的基因表达差异，我们用三个平行的生物复制对上述12个巨噬细胞亚群进行了RNA-seq分析（图1a）。转录组分析确定了12690至15247个蛋白质编码基因，每千碱基外显子模型中每百万个片段映射（FPKM）一群细胞中均超过一个片段，共检测到15596个蛋白编码基因，具有高重复性（图1b）。
然后，我们系统地将我们的转录组数据与已发表的大规模元数据进行了比较，其中共有466个RNA-seq文库被很好地整合。结果，相同巨噬细胞亚群的两个数据集之间的spearman相关系数约为0.75，这显著高于不同细胞类型的两个数据集之间的相关系数。值得注意的是，大肠巨噬细胞是一个例外，这可能是因为元数据分析中的大肠巨噬细胞来源于CD11c DTR小鼠模型中的单核细胞转移亚群，导致在我们的研究中，样本的转录组与来自正常小鼠的所有巨噬细胞亚群的转录组之间的相关性较差。在我们的研究中，与源自正常C57BL/6N小鼠的巨噬细胞亚群的转录组的相关性显著降低。我们还比较了已发表的巨噬细胞蛋白质组和我们的蛋白质组数据集，发现相同巨噬细胞的数据之间的平均相关系数为0.7，显著高于不同巨噬细胞的数据。通过比较已发布的数据、我们的转录组和蛋白质组数据中的标记基因的量化值，我们发现三个数据集中细胞类型特异性基因的表达具有良好的一致性。此外，不同巨噬细胞的一些潜在核心特征的表达水平，如小胶质细胞中的Mef2a、Mef2c、Mef2d和Sall1；肺泡中Pparg、Stat5a和Stat6；星状巨噬细胞中的Rxra、Nr1h3和Vcam1；腹腔巨噬细胞中的Gata6、Itga6和Tgfb2在已发表的表观基因组和转录组以及我们的蛋白质组中显示出高度一致性。
结果表明，我们的转录组学和蛋白质组学数据捕获了不同巨噬细胞亚群的特征图谱，为比较小鼠巨噬细胞亚群的蛋白质组和转录组提供了参考。
2. 12个巨噬细胞亚群的蛋白质组学和转录组学数据的比较
我们的蛋白质组和转录组数据集的综合分析显示，鉴定中存在高度重叠。15596个蛋白质编码转录物中，共有11327个在蛋白质水平上检测到，代表蛋白质组数据集的深度覆盖（图1c）。我们发现，巨噬细胞转录物拷贝约为5个数量级，平均比蛋白质拷贝数低约8000倍（图1d）。一致地，先前对细胞类型解析的肝脏蛋白质组的研究也表明，转录物的拷贝数比各种细胞类型的蛋白质的拷贝数相对较低。
为了系统地确定转录组和蛋白质组在基因鉴定和定量方面的差异，我们比较了两个数据集之间共同鉴定和单独鉴定基因的表达水平。如图1e所示，低丰度转录物通常在蛋白质水平上检测不足，包括大量嗅觉受体，这些受体预计与巨噬细胞亚群功能无关。然而，我们还发现了一些缺失的蛋白质，其转录物具有更高的拷贝数。为了探索蛋白质缺失检测的原因，我们根据转录组水平上的平均表达值和识别频率将缺失的蛋白质分为四组（图1f），通过基因注释分析（图1g），我们发现具有高量化值和识别频率的基因与泛素化修饰、转录调节、核糖核蛋白、跨膜蛋白和分泌蛋白相关。由于这些基因编码的蛋白质的生物学功能特征、物理化学性质、特定的细胞定位，质谱很难识别它们。R4区域中的64个基因（图1f）代表特异性表达的转录物，其中大多数是分泌蛋白或与特定免疫应答相关，如星状巨噬细胞转录组中鉴定的Mup家族基因和肠道中的Defa家族基因。
同时，我们还用相同的策略分析了缺失转录物的蛋白质组特性（图1f&g）。结果表明，16%缺失转录物编码的蛋白质被鉴定为高频率，并且显著富集了细胞骨架相关功能。先前的研究表明，作为结构蛋白，细胞骨架蛋白是稳定的，而相应转录物的半衰期很短。与缺失的蛋白不同，大多数缺失的转录物在蛋白质水平上适度表达，识别频率较低。在这些没有转录物信号的适度定量的蛋白质中，我们注意到（1）约35%的蛋白质在不同细胞中仅鉴定一次，反映了质谱测量中的瞬时蛋白质表达或噪声；（2）一半的蛋白质在一个或两个亚群中被特异性鉴定，如小胶质细胞中的Cbln2/3/4和星状巨噬细胞或肠道巨噬细胞中的Slc蛋白，可能表明相关组织中巨噬细胞的吞噬能力。此外，外泌体中一些缺失转录物的蛋白质产物的富集也表明巨噬细胞的吞噬活性。
然后，我们研究了转录组和蛋白质组中11327个基因和蛋白质的相关性，结果表明不同巨噬细胞亚群中的定量转录物和蛋白质之间存在中度相关性（图1h），与之前的研究一致。只有28%的蛋白质与同源RNA存在显著相关性大于0.57（图1i），表明蛋白质组模式只能在有限程度上由转录组模式解释。基因功能注释显示，0.5%的蛋白质与同源RNA呈显著负相关，其参与RNA剪接或转录起始，而27%与同源RNA呈正相关的蛋白质，其参与管家功能和经典免疫途径（图1j），例如，参与炎症反应的蛋白质，如细胞因子（Cxcl2）、适配分子（Fadd和Myd88）、受体（Ccr2、Tlr5和Tlr12）和转录因子（Stat5a、Stat6和Runx3），与其相应的mRNA显示出高度相关性（图1k）。
3. 不同巨噬细胞亚群的比较蛋白质组分析揭示了不同巨噬细胞亚群组织特异性和免疫特异性功能
为了探索不同巨噬细胞亚群的功能特性，我们进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），定义了12个巨噬细胞亚群的共表达基因模块。该算法产生了40个细胞类型特异性模块，包含来自12个巨噬细胞亚群中11298个标识的35-1080个蛋白质。为了基于CTM准确识别不同巨噬细胞亚群的功能特征，在具有基因显著性（GS）临界值的模块中总共有6103个高置信基因，并对其进行基因本体（GO）富集分析（图2a）。该分析基于不同巨噬细胞亚群的蛋白质组特征将其基因特征分组到其相关的CTM中（图2b），准确筛选了代表性的标记蛋白，如小胶质细胞中的Slc1a3、Mef2a/c、Sall1/3和P2ry12；肺泡巨噬细胞中的Car4和Siglecf；星状巨噬细胞细胞中的Clec4f、Vsig4和Timd4；脾脏巨噬细胞中的Spic（图2b）。
基因注释分析表明，CTM的特性与固有组织的功能高度一致，表明巨噬细胞群参与相关器官支持活动（图2c），例如，肺泡巨噬细胞CTM中的蛋白质被认为参与了氧化应激反应和脂质代谢调节，有效地将肺泡巨噬细胞与肺保护的平衡联系起来。星状巨噬细胞的CTM富含脂肪酸、外源代谢以及凝血过程，这表明星状巨噬细胞在肝脏代谢和凝血调节中发挥支持作用。肠道巨噬细胞的CTM以粘膜免疫反应和白细胞迁移为特征，表明肠道巨噬细胞在调节肠道稳态中的潜在作用（图2c），这些结果表明组织过巨噬细胞与相关组织的特定功能之间存在着密切的联系。不可否认的是，在巨噬细胞分离过程中，吞噬活性和非相关细胞功能产生的污染也可能解释了不同巨噬细胞亚群中存在大量组织特异性的原因。
除了非免疫相关的组织支持活动外，巨噬细胞还广泛表达参与先天免疫应答的蛋白质，其中模式识别受体（PRR）对病原体相关分子模式（PAMP）的识别起着核心作用。PRR通路中的分子已经被充分探索，但它们在不同巨噬细胞亚群中的表达模式仍然未知。我们的CTM系统捕获了12个巨噬细胞亚群中133个PRR信号通路相关蛋白的表达异质性。大多数PRR途径蛋白在人群中广泛表达，而它们在不同巨噬细胞中的表达水平不同。例如，Tlr5、Nlrc4、Naips等被显著识别为肺泡巨噬细胞的CTM，Nod1、Trmps等在Kupffer细胞中高度表达，Tlr1、Tlr12、P2x7等在肠道巨噬细胞中表达显著（图2d）。网络中紧密相关的蛋白质可能表明巨噬细胞对不同PAMP的反应具有功能多样性。
在PRR信号通路中，Toll样受体（TLR）通路已被确定为热点。我们的研究为全面剖析分布在全身巨噬细胞中的整个TLR家族提供了参考。本研究中几乎鉴定了从TLR1到TLR13的所有TLR（TLR10和TLR11除外）。大多数TLR在所有巨噬细胞中表达，然而，某些TLR在特定类型的巨噬细胞中显著富集，这表明不同的巨噬细胞在先天免疫应答中具有不同的特性。发现肠道巨噬细胞表达几乎所有TLR（TLR10和11除外），揭示了它们对肠道中不同类型病原体的广泛免疫识别（图2e）。发现TLR5主要在肺泡巨噬细胞中富集，表明肺中鞭毛蛋白的识别被激活。TLR4在星状巨噬细胞中过度表达，表明星状巨噬细胞对脂多糖（LPS）刺激的反应能力很高（图2f），已发表的小鼠组织巨噬细胞流式细胞荧光分选技术（FACS）数据很好地支持了这一结果。
4. 巨噬细胞蛋白质组揭示了转录因子调节网络和巨噬细胞与相关组织之间的串扰
基于之前细胞功能和组学技术的研究，我们强调了转录因子（TFs）在不同巨噬细胞中的重要作用。我们当前研究中蛋白质组的深度覆盖使我们能够描述不同巨噬细胞亚群的TF模式。在蛋白质组数据中，共检测到510个TFs，范围从BMDM中的233个TFs到小胶质细胞中的338个TFs。我们基于发现某一细胞类型中TF的表达水平比其他细胞类型中表达水平的几何中值高五倍的标准来确定哪些TF是细胞类型特异性的。我们定义了一组细胞类型特异性TFs（图3a），并阐明了12个研究巨噬细胞亚群中的代表性特异性TFs。我们的蛋白质组数据成功捕获了一些已知的细胞类型特异性TFs。相比之下，与免疫功能相关的典型TFs在12个巨噬细胞亚群中普遍表达。
基于巨噬细胞蛋白质组数据中TF的深度覆盖，我们构建了12个巨噬细胞亚群的TF相互作用网络，我们发现，在12个巨噬细胞亚群中，TF的普遍性与其参与的PPI数量之间存在显著的正相关。无处不在的TFs，特别是免疫相关的TFs，如NF-ĸB，Stats等被发现参与了许多TF-TF相互作用，这意味着无处不在的TFs通过TF-TF交互作用参与了多种细胞转录程序。研究结果表明广泛识别的TFs图谱，如Cebpb和Sfpi1（Pu.1），可以作为网络中的枢纽，并连接到其他细胞类型特异性TFs，包括小胶质细胞中的Smad3和Cebpa、星状巨噬细胞中的Srf和Notch1等。
为了进一步在功能上探索关键的TFs，我们着手鉴定细胞类型维持TFs（ctmTFs），即维持不同巨噬细胞类型所需的TFs。在本研究中，我们使用CellNET45的TF下游靶基因（TG）数据库和TF模式。我们推断，ctmTFs不仅应在巨噬细胞亚群中特异性富集，而且还应主要控制其下游基因在巨噬细胞中的转录。因此，在12个测试的巨噬细胞亚群中鉴定出92个ctmTF，范围从BMDM中的2个TFs到RAW264.7细胞系中的24个TFs。如图3b所示，基于ctmTF比对和CTM导出的ctmTF TG网络，我们展示了驱动每个不同巨噬细胞亚群内异质性的潜在机制，例如，肺泡巨噬细胞的CTM中的蛋白质，包括参与脂质代谢的Abcg1、Plin2、Abhd5、Adipor2等，受肺泡巨噬细胞的ctmTF调节，包括Hopx、Lef1、Pparg和Atxn1，以及参与代谢或凝血的靶基因（Slcs、Cyp2c50、Apoa2、C1qa、F9等）在星状巨噬细胞中过表达。此外，我们在多个组学层面和蛋白质组数据中发现了ctmTF和TGs的关联，例如，Pparg及其靶基因Abcg1在肺泡巨噬细胞中特异性表达、Elf3及其靶基因St14在大肠巨噬细胞中特异性表达。与这些结果一致，使用H3K4me1 ChIP seq和ATAC seq揭示的Abcg1和St14的表观基因组激活信号分别在肺泡巨噬细胞和大肠巨噬细胞中过度表达（图3c）。ctmTF汇总结果如表1所示。
表1. 12中不同巨噬细胞的ctmTF个体发育和局部环境信号可以改变细胞身份，并对巨噬细胞的异质性产生影响。我们的功能模块分析和12个巨噬细胞亚群的以TF为中心的细胞类型特异性网络表明，组织固有巨噬细胞和相关组织之间存在潜在的串扰。为了研究组织-巨噬细胞串扰网络，我们对八个组织的蛋白质组进行了三次重复分析，并确定了每个组织3956个（腹腔灌洗液）和6762个（肺脏）蛋白质，以及来自所有八个组织的总共10669个蛋白质。
我们使用CCCEXPLOR通过确定组织中发现的配体如何与巨噬细胞中发现的受体、特异性TFs及其下游TGs连接来推导分层串扰网络（图4a）。串扰网络中富集的途径主要与巨噬细胞的组织功能调节有关，这表明组织环境在塑造和保持不同巨噬细胞亚群各自身份方面的作用（图4b）。以大脑和小胶质细胞之间的串扰网络为例，来自大脑的配体（Cx3cl1、Sema7a、Fgf8、Gnas等）和来自小胶质细胞的受体（Cx3cr、Itgb1、Fgfr4、Adcy7）、TFs（Jun、Mef2a、Mef2c、Smad3）、TGs（Bin1、Pacsin1、Duoxa1等）和神经发生的正调节形成了一个相互联系的串扰网络（图4d)。使用相同的方法，我们确定了8个组织和相关11个巨噬细胞亚群的串扰网络的结构，并描述了它们的特征通路，包括缺氧反应（肺泡巨噬细胞）、脂质储存和铁离子转运（星状巨噬细胞）、凝血（脾巨噬细胞）、白细胞分化（肠巨噬细胞）和髓系细胞分化（BMDM）等。以TFs为中心的网络为组织微环境在建立巨噬细胞分类方面中发挥的突出作用提供了参考。
5. 蛋白质组模式的分级聚类区分了不同的巨噬细胞亚群，揭示了组织固有巨噬细胞和招募巨噬细胞之间的差异
基于上述衍生的组织-巨噬细胞串扰网络，我们计算了其连接的数量，有趣的是，我们发现固有巨噬细胞与其固有组织之间的联系数大于招募的巨噬细胞与肝和肺之间的联系（图4c)，这一观察表明，组织环境对形成组织固有和招募巨噬细胞的功能有不同的影响。
为了进一步研究组织过和招募巨噬细胞之间的差异，我们对巨噬细胞蛋白质组进行了主成分分析（PCA），该分析还揭示了组织固有和募集巨噬细胞之间的显著差异（图5a）。蛋白质组模式的无监督分级聚类分析产生了三个亚群：亚群1包括小胶质细胞、星状巨噬细胞和肺泡巨噬细胞，即典型的组织固有巨噬细胞；亚群2主要由HSC衍生的巨噬细胞组成，包括组织招募的巨噬细胞、小肠和大肠巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和BMDM；亚群3包括RAW264.7细胞系（图5b）。与亚群1中典型固有巨噬细胞的蛋白质组模式不同，脾脏巨噬细胞的蛋白质结构模式与脾脏招募的巨噬细胞的相对相似。此外，将RAW264.7分类为单独的亚群（即亚群3）进一步表明了原代巨噬细胞和细胞系之间的差异。
接下来，我们探讨了三个亚群的巨噬细胞亚群之间的功能差异。在这里，我们使用GO注释对差异表达的蛋白质进行富集分析，我们发现亚群1中的巨噬细胞富含组织调节功能，包括细胞对金属离子的反应和羧酸生物合成过程等；亚群2中的巨噬细胞亚群具有免疫特性，特别是细胞趋化性和粘附性；亚群3中的RAW264.7以核糖体生物发生和细胞周期检查点为特征（图5c–e）。这种多样性揭示了非典型的组织固有巨噬细胞参与细胞运动，而典型的组织固有巨噬细胞主要参与组织稳态和功能调节。
趋化和粘附是免疫细胞归巢的关键过程，并最终决定它们的微环境。我们发现，在招募的巨噬细胞中，趋化因子、趋化因子受体和粘附分子的表达水平高于肺和肝中的固有巨噬细胞（图5f&g)。相反，在肺和肝中，固有巨噬细胞表达的PRR量高于招募的巨噬细胞（图5h)。因此，我们推测，与固有巨噬细胞相比，招募的巨噬细胞更具移动特性，但PAMP反应能力较低。为了进一步验证这一推测，我们研究了趋化因子受体的表达水平与三个器官（肝、肺和脾）的成对固有和招募巨噬细胞中PRR的相关性。如图5i所示，趋化因子受体和PRR之间表达的相关系数为-0.76，表明细胞迁移率和PAMP响应能力之间的负相关，结果表明组织固有和组织招募巨噬细胞亚群的不同分子表型。
6. 肺和肝中组织固有和招募巨噬细胞的功能多样性
为了探讨同一组织中固有和招募的巨噬细胞之间的差异，我们研究了肺、肝和脾中三对组织固有和招募巨噬细胞的蛋白质组模式之间的Pearson相关系数。如图6a所示，脾脏和招募巨噬细胞的蛋白质组模式之间的相关系数为0.66，该值显著高于肺泡和招募巨噬细胞模式之间的值，以及星状巨噬细胞和肝脏招募巨噬细胞模式间的值。这种差异可能是由于脾脏是一种有特点的免疫组织，其中固有的巨噬细胞和招募的巨噬细胞都是活跃的。如图6b所示，确定招募的巨噬细胞和固有的巨噬细胞分别在肺和肝中共聚集，表明巨噬细胞来源之间的差异大于组织环境衍生的差异。
然后，我们分别研究了肺和肝中固有和招募的巨噬细胞之间的功能差异。与肝脏招募的巨噬细胞相比，星状巨噬细胞主要参与肝脏的生物处理和功能调节（图6c），涉及铁离子稳态、胆固醇转运和LPS介导的信号传导等过程，而肝脏招募的巨噬细胞参与免疫调节，包括白细胞迁移、细胞-细胞粘附和血管生成（图6d）。肺部也发现了类似的现象，我们发现肺泡巨噬细胞的特征在于Pparg信号、pH调节和PRR信号，表明肺泡巨噬细胞参与器官功能辅助。相反，白细胞迁移、髓系细胞分化）和病毒生命周期在肺招募巨噬细胞中占主导地位（图6e&f）。
上述分析揭示了免疫和非免疫相关生物过程中，特别是肝和肺中，组织固有的巨噬细胞和招募的巨噬细胞之间的功能特征和相关分子特征。结果强调：（1）组织固有巨噬细胞优先参与组织功能调节，（2）组织招募的巨噬细胞比固有巨噬细胞具有更高的趋化和粘附能力以及更低的PAMP识别能力。
7. 肺和肝中组织固有和募集巨噬细胞之间的不同分子特征和细胞功能
目前，F4/80和CD11b作为区分组织固有和招募巨噬细胞的相对指标。当前工作中蛋白质组数据的深度覆盖使我们能够搜索其他新的蛋白质标记来区分这两个亚群。因此，四种蛋白质，包括组织固有巨噬细胞中的Muc1、Marco、Pdl1和招募巨噬细胞中的Clec5a被鉴定为标志性分子，以区分肺和肝中固有的组织和招募的巨噬细胞。然后，我们使用流式细胞术验证了两种巨噬细胞亚群之间的表达差异（图7a）。
与招募的巨噬细胞相比，PRR途径，如Nlrp3炎症小体信号传导，在组织固有巨噬细胞中发现相对较多。Il18是一种参与Nlrp3信号通路的细胞因子，在这方面被列为差异表达明显的蛋白质之一，在肺和肝中都存在（图6d，f）。此外，我们还发现炎症小体途径中的其他蛋白质，在组织固有巨噬细胞中的表达水平显著高于招募的巨噬细胞（图7b)。使用蛋白质免疫印迹，我们确认了两种类型的巨噬细胞之间Nlrp3、Casp1、Nek7和Il18（与炎症小体途径密切相关的蛋白质）表达水平的差异（图7c）。这些结果表明，组织固有巨噬细胞的炎症反应可能比招募的巨噬细胞更活跃。为了证实这一假设，我们比较了LPS刺激的两种巨噬细胞之间的炎症反应因子水平，并对肺和肝中的巨噬细胞进行了比较。在LPS刺激下，组织固有巨噬细胞以比招募的巨噬细胞高得多的水平表达Il18和Nlrp3炎症小体相关蛋白（图7c）。此外，通过MS分析检测了其他相关蛋白，证实了组织固有巨噬细胞中的炎症反应更强。
Il18是一种促炎细胞因子，可增强抗CD3刺激的Th1细胞产生干扰素（IFN）-γ，尤其是与Il1249相关。因此，我们假想组织固有巨噬细胞是否能比组织招募巨噬细胞更有效地激活T细胞。为此，我们构建了体外共培养系统测定，其中从脾脏分离的CD4+ T细胞分别与肺泡巨噬细胞或肺募集巨噬细胞共孵育。48 小时后收获共培养系统的上清液并测量IFN-γ水平以评估T细胞的活化水平。发现与肺泡巨噬细胞共培养的T细胞中IFN-γ的表达水平显著高于与肺巨噬细胞共培养T细胞中的表达水平。然而，用Il18抗体中和Il18后，肺泡巨噬细胞组T细胞中IFN-γ的表达水平下降（图7d）。在LPS刺激下，除了炎症小体和Il18在肺泡巨噬细胞中的主要表达外，我们注意到，与组织招募的巨噬细胞相比，肺泡巨噬细胞存在时T细胞的活性水平显著增加，并且在Il18中和后下降（图7e），提示组织固有巨噬细胞Il18在激活T细胞中的潜在作用。
为了进一步研究Il18在区分两种巨噬细胞亚群的分子特征和细胞功能特征中的作用，我们建立了Il18−/− 小鼠。使用CD4+T细胞和巨噬细胞的共培养系统，我们发现肺泡巨噬细胞激活T细胞的能力从野生型小鼠的相对高水平下降到了Il18−/−小鼠的相对低水平，即在正常和LPS刺激条件下达到与招募的巨噬细胞相似的水平（图7f&g）。同样，在LPS刺激下，我们发现Nlrp3、Caspase和Nek7在Il18−/−小鼠的肺和肝的组织固有和募集巨噬细胞中表达相似（图7c）。我们对野生型和Il18−/−小鼠的肝脏和肺部两个巨噬细胞亚群进行了蛋白质组分析，蛋白质组分析显示，在WT小鼠中识别的组织固有巨噬细胞和招募巨噬细胞之间的差异蛋白质组模式在Il18−/−小鼠中趋于减少（图7h）。在LPS刺激下，上述标记分子，包括Marco、Muc1、Pdl1和Clec5a，在Il18−/−小鼠的肺泡巨噬细胞和招募的巨噬细胞中表达程度相当（图7i）。这些结果表明，Il18在维持肺和肝中组织固有和招募巨噬细胞的分子特征和细胞功能特征方面，特别是在炎症反应和激活T细胞的能力方面，具有潜在作用。
在LPS诱导的急性肝损伤模型中，对野生型和Il18−/−小鼠进行了实验，我们注意到Il18−/−小鼠的死亡率更高（图8a）。在LPS刺激下，Il18−/−小鼠肺和肝中的炎症水平也较高，Il18−/−小鼠存活率均高于野生型小鼠（图8b）。同时，在野生型小鼠中，肝脏募集巨噬细胞的细胞计数为7E5/小鼠，在Il18−/−小鼠中增加到1E6/小鼠；在野生型小鼠中，招募的巨噬细胞占巨噬细胞总数的比例为55%，在Il18−/−小鼠肝脏中增加到77%（图8c&d），结果表明，Il18在调节组织固有巨噬细胞的单核细胞募集能力方面起着负性调节作用。
为了验证Il18的负面作用，我们培养了从野生型和Il18−/−小鼠分离的星状巨噬细胞，用LPS或PBS处理的小鼠。6 小时之后、对该群细胞进行LC-MS测量。对于用LPS处理的小鼠的巨噬细胞，共鉴定了6599种蛋白质。蛋白质组数据的生物信息学分析表明，招募单核细胞的趋化因子（如Ccl7和Cxcl12）在Il18−/−小鼠的星状巨噬细胞中表达水平较高（图8e）。因此，我们认为星状巨噬细胞招募单核细胞的能力在Il18−/−小鼠中上调。为此我们在野生型和Il18−/−小鼠中培养和刺激星状巨噬细胞，并检测了RAW264.7细胞在星状巨噬细胞上清液处理后的迁移能力。结果显示Il18−/−小鼠中RAW264.7的迁移细胞计数高于野生型组，表明星状巨噬细胞在Il18−/−小鼠中招募单核细胞的能力更强（图8f）。
基于上述的结果，我们揭示了Il18在维持这些组织固有和招募的巨噬细胞的分子特征和细胞功能特征方面的关键作用，特别是在炎症反应和激活T细胞的能力方面。此外，我们发现星状巨噬细胞在Il18−/−小鼠中招募单核细胞的能力增强，这可能导致Il18−/−小鼠在LPS刺激后出现高死亡率的原因。
讨论
巨噬细胞是一种非常关键的细胞类型，从胚胎发育开始，几乎存在于所有组织中。除了在先天免疫防御和凋亡细胞清除中的作用外，巨噬细胞在相关组织中的调节功能也越来越受到重视。在这里，我们深入描述了十种不同的原代巨噬细胞亚群和源自C57BL/6N小鼠的BMDM的蛋白质组和转录组，为阐明不同类型巨噬细胞的不同功能提供了全面的蛋白质和mRNA表达模式。考虑到缺乏C57BL/6N同源细胞系，我们选择RAW264.7作为小鼠细胞系，以与原代巨噬细胞进行比较。当然，RAW264.7细胞系不是C57BL/6细胞系，实验时还应注意小鼠亚株的影响。
蛋白质组学和转录组学数据与已发表数据的比较表明，我们阐明了相关巨噬细胞亚群的基因表达谱特征。值得注意的是，我们的数据以及几乎所有以前可用的巨噬细胞亚群数据都是小鼠特异性的，尤其是C57BL/6种属特异性的。巨噬细胞个体发育、发育和稳态的细节可能因不同物种甚至不同的小鼠类型而异，使用C57BL/6类型作为单核细胞/巨噬细胞研究模型的注意事项已得到充分论证。不同物种和小鼠类型之间的巨大差异值得在未来研究中进一步分析。
我们的数据集为探索同一细胞类型的蛋白质组和转录组之间的差异提供了参考。我们发现超过75%的缺失蛋白转录本的表达水平低于总转录组的中值表达水平。这些低丰度转录物可能无法在蛋白质水平上表达，或者它们的表达水平可能太低而无法被MS检测到。由于特定的翻译后修饰和细胞外定位，其他20%的缺失蛋白质没有被检测到。一些缺失的蛋白质是膜蛋白或TFs，无论同源RNA表达丰度如何，MS都很难检测到它们，这可能是因为它们很难通过裂解提取。此外，我们发现一些缺失蛋白质的半衰期很短。蛋白质组学的未来方向之一是提高蛋白质组鉴定的覆盖率和灵敏度，导致蛋白质缺失或转录物信号缺失的关键原因也值得进一步研究。
巨噬细胞蛋白质组景观的比较分析解析了生理状态下不同原代巨噬细胞的代表性基因特征和功能异质性，并描述了每种类型巨噬细胞的免疫和非免疫相关生物过程的特征，该结果为开展巨噬细胞功能和机制的新研究提供了参考。值得注意的是，我们研究中使用的细胞是通过酶消化和FACS纯化获得的。这些操作可以在稳态条件下激活巨噬细胞，促进立即表达的基因和炎性细胞因子的激活。此外，由于巨噬细胞是一种吞噬细胞，被这些细胞吞噬的组织蛋白也被MS捕获。这可能会影响我们研究中基于WGCNA的基因簇和功能分析结果。这是当前研究不可避免的局限性。我们将在随后的研究中探讨来自不同实验程序的扰动对原代细胞基因表达谱的影响。
影响蛋白质或转录物定量的另一个因素是细胞污染。Summers等人进行的Meta分析表明，已发表的巨噬细胞转录组数据集受到分离的制剂直接与其他细胞类型的广泛污染或可能与活体中MPS细胞相互作用的细胞类型的共纯化的影响，我们使用9-10个标记物对每个原代细胞群进行分类，以确保巨噬细胞制剂的纯度高于98%。不相关细胞可能的干扰或污染也会影响mRNA或蛋白质定量结果以及后续数据分析，这是当前研究不可避免的局限性。首先，污染源于巨噬细胞的吞噬活性，其中可以检测到吞噬细胞中的RNA/蛋白质。第二，由组织消化过程中被巨噬细胞残余物包裹的无关细胞引起的扰动。第三，巨噬细胞和其他细胞群之间的紧密相互作用也导致了这种结果。这种污染可以解释一些现象，即某些组织中常见的特定蛋白质可能在从同一组织分离的巨噬细胞中发现。此外，该问题可能会影响我们研究中基于WGCNA的基因聚类和功能分析结果。因此，在随后的研究中，有必要探讨来自不同实验程序的扰动对原代细胞基因表达谱的影响。
鉴于心脏巨噬细胞在组织支持活动中的重要功能，我们还基于特定的分类策略整理了心脏巨噬细胞的蛋白质组数据。基于466个大体积RNA序列数据集的Meta分析表明，从心脏分离的巨噬细胞中没有独特的表达谱，因此我们的蛋白质组数据集为心脏巨噬细胞研究提供了参考。
先前的研究使用了不同的组学（表观基因组和转录组学）方法来定义巨噬细胞的关键TFs。Lavin等人使用全基因组分析筛选了八种不同巨噬细胞亚群中的调节元件。基于他们的TF DNA结合基序分析结果，他们预测了许多调节候选标志物，如Runx2、Stats、Smads等。在我们目前的研究中，我们直接鉴定了细胞特异性TFs，并证实了负责维持不同巨噬细胞身份的ctmTFs。
在同一组织中固有的组织和招募的巨噬细胞的功能特征以前尚未完全表征。在我们当前的研究中，观察到组织固有巨噬细胞和招募巨噬细胞的蛋白质组模式之间的显著差异，使我们能够评估这两个巨噬细胞亚群的功能多样性，特别是在肝脏和肺部：（1）固有巨噬细胞主要参与组织功能调节，与招募的巨噬细胞相比，与组织有更多的联系；（2）与固有的巨噬细胞相比，招募的巨噬细胞表现出更大的趋化性和粘附能力以及更低的PAMP识别能力；（3）IL18可能在区分两种巨噬细胞亚群的特征身份方面发挥重要作用。
总之，我们提供了不同组织中巨噬细胞亚群的综合蛋白质组和转录组数据集，这一丰富的资源不仅揭示了不同巨噬细胞亚群的功能多样性，还可以作为未来巨噬细胞生物学研究的起点，从而更好地了解全身巨噬细胞的免疫相关和非免疫相关功能。
https://www.nature.com/articles/s41467-022-35095-7
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