科研（IF:66.850）|Cell：三维完整标本中的空间蛋白质组学

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编译：微科盟-张金伟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

复杂组织的空间分子谱分析对于研究生理和病理状态下的细胞功能至关重要。然而，缺乏对3D成像的大型生物标本进行分子分析的方法。在这里，我们介绍了DISCO-MS技术，这是一种结合了全器官/全生物体透明化和成像、基于深度学习的图像分析、机器人辅助组织取样和超高灵敏度质谱分析的技术。DISCO-MS产生的蛋白质组数据与啮齿动物和人体组织中未透明化的样本无法区分。我们使用DISCO-MS技术研究脑损伤后沿轴突束的小胶质细胞激活，并在阿尔茨海默病小鼠模型中表征早期和晚期个体淀粉样蛋白-β斑块。 DISCO-bot机器人辅助样本提取使我们能够研究完整小鼠体内免疫细胞和完整人类心脏主动脉斑块的区域异质性。在对整个标本进行3D无偏成像后，DISCO-MS技术能够对临床前和临床组织进行无偏蛋白质组分析，从而确定复杂疾病的诊断和治疗机会。

简述DISCO-MS和DISCO-bot两种技术结合，通过对大型透明化样本的全景成像、计算机重建和自动微创机器人辅助组织提取识别的小组织区域进行无偏的空间蛋白质组分析。要点1.DISCO-MS是一种空间蛋白质组学技术，适用于光学透明的整个标本2.DISCO-MS在人工智能和机器人技术的辅助下进行与新鲜样品类似的蛋白质组研究3.由DISCO-bot辅助下DISCO-MS的技术揭示了小鼠骨骼中的空间免疫细胞的异质性4.由DISCO-bot辅助下DISCO-MS的技术揭示了人类冠状动脉斑块的异质性

论文ID

原名：Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens译名：三维完整标本中的空间蛋白质组学期刊：CellIF：66.850发表时间：2022.12通讯作者：Matthias Mann; Ali Ertürk通讯作者单位：德国慕尼黑大学

实验设计

实验结果

在早期阶段，许多疾病在大部分未知的组织区域都有轻微的病理变化，因此难以识别和表征。例如，痴呆症的早期变化可能包括一些局部炎症细胞的激活、微血管系统的变化，以及在未表征的大脑区域出现一些初始的β淀粉样蛋白斑块。这种微小的区域变化使用标准组织学极难识别，因此限制了我们在调查疾病初始阶段以进行早期诊断和治疗。通过最新的组织透明化技术，我们可以对包括小鼠器官和全身以及完整人体器官在内的完整生物组织进行荧光成像。在组织变得透明后，通过端到端激光扫描显微镜（end-to-end laser scanning microscopy）可以揭示它们的细胞和亚细胞细节。利用人工智能(AI)模拟或协助进行的图像分析，可以轻松快速地识别出细胞结构中可能会被遗漏的微小变化。相对而言，仅凭视觉精确定位这些区域并不能在分子水平上回答这些问题。与此同时，尽管一些研究表明RNA表达可能与蛋白质表达弱相关，但在提高单细胞转录组技术的通量方面目前已经取得了巨大进展。最近，随着基于超高灵敏度质谱(MS)方法的出现，使得单细胞蛋白质组学的分析技术成为了可能。在RNA水平上，可以保留二维(2D)样本中的空间背景，因为空间分辨转录组分析正迅速成为分子生物学工具包的主流技术。目前空间蛋白质组分析方法得到了积极开发，但大多数方法要么限于分析少于100种蛋白质（例如，基于传统的、高度可依赖的多重免疫荧光技术Multiplex immunofluorescence（MxIF）），要么限于2D样本（例如，基于MS的空间蛋白质组学）或两者兼而有之。此外，尚不清楚这些方法可以在多大程度上与光学透明组织的高级全器官成像兼容。在本研究中，我们将全器官和全小鼠组织透明化技术和组织成像与基于MS的超高灵敏度蛋白质组分析相结合，可以表征从含有少于100个细胞的透明化组织中分离出的样品的蛋白质组。我们将这种方法称为通过质谱分析的有机溶剂透明化器官的三维 (3D) 成像（或 称作DISCO-MS）（图 S1A）。使用 DISCO-MS，我们成功地分析了从整个小鼠或人体器官中分离出来的荧光标记的小范围目标区域，以发现各种疾病模型中初始病理事件的空间分子概况。为了便于样本提取，我们开发了一种新型的机器人组织提取系统（称为 DISCO-bot），用于更具挑战性的标本，包括整个成年小鼠身体和整个人体器官。通过结合DISCO-MS 和DISCO-bot，我们研究了来自完整小鼠骨髓生态位和人类心脏主动脉斑块的免疫细胞富集组织的空间蛋白质组异质性。图 S1. 优化透明化组织的样品制备，与图 1 相关(A) 从透明化大量组织到质谱分析的DISCO-MS优化工作流程。 器官可以从任何有机体中分离出来，然后通过任何基于有机溶剂的组织清理来透明化。透明化后的组织然后进行我们为质谱分析开发的样品制备工作流程。简而言之：组织被溶解、还原和烷基化，消化成胰蛋白酶蛋白并进行清理，为液相色谱联用质谱 (LC-MS) 分析做好准备。 (B) 来自新鲜或透明化小鼠大脑的SDC、SDSSDC或 TFESDC制剂的分析重复的蛋白质鉴定（3D、uD：分别为3DISCO 和uDISCO透明化方法）。 (C)： (B) 中所示样品的肽水平。 (D)： (B) 和 (C) 中提供的测量的蛋白质组相关矩阵。高Pearson相关性表明SDSSDC和 TFESDC在不同条件下的蛋白质组非常相似。
1. 对溶剂透明化组织的基于MS的蛋白质组学
组织透明化是一种化学过程，它依赖于组织透化作用和随后提取不同的生物分子，包括水（基于有机溶剂的方法）和脂质（在大多数透明化方法中）。然而，我们不清楚在这些不同的提取步骤过程中，组织中的蛋白质组是否保持完好？为研究这一点，我们采用了基于 MS 的蛋白质组学，它可以提供对整个表达蛋白质的组成、结构和功能的公正深入的洞察。为此，我们将溶剂透明化样品置于蛋白质组学工作流程中，以了解蛋白质回收率以及定性和定量重现性。使用新鲜冷冻组织作为对照，我们从3DISCO和 uDISCO透明化方法开始（图 S1B–S1D），这两种常用方法快速且已知可提供最高的组织和器官透明度。我们测试了几种蛋白质溶解方法和认为基于SDS的蛋白质增溶和组织粉碎的组合，然后是SDC再增溶和蛋白质消化，在新鲜和基于溶剂的透明化方法之间产生了定性和定量上非常相似的蛋白质组（图 S1B 和 S1C）。我们在各种条件下鉴定了多达5,500种蛋白质，Pearson相关系数在 0.89 和 0.99 之间（图 S1D）。虽然3DISCO和uDISC适用于荧光染料成像，但内源性荧光蛋白（如 EGFP）的信号相当不稳定并会随时间衰减。为避免这种情况，我们开发了vDISCO，它使用荧光染料偶联的纳米抗体来稳定和增强荧光信号。由于vDISCO包括几个可能改变蛋白质组构成的额外步骤，我们还在这些组织上测试了我们的蛋白质组学工作流程。在包括vDISCO在内的所有透明化清理条件下鉴定超过 6,000种蛋白质，并使用Pearson相关系数从0.85到0.94进行复制，证实了我们工作流程的适用性（图 1A）。接下来，我们询问是否可以使用DISCO和 SHANEL方法对保存在福尔马林中超过5年的人脑组织进行分析和透明化清理。 DISCO-MS在所有透明化条件下鉴定出超过 5,000种与多聚甲醛非常相似的蛋白质（PFA)-固定控制，具有高定量重现性 (R = 0.91–0.96)（图 1B）。 我们得出结论，我们的样品制备工作流程允许对透明化的小鼠和人类标本进行基于MS的蛋白质组分析，其深度和定量精度与新鲜和PFA固定的对照样品相当。图1. 透明化的啮齿动物和人体组织的蛋白质组(A) 不同的基于有机溶剂的组织透明化方法与新鲜对照后小鼠脑组织的蛋白质组分析。显示了所有透明化技术和新鲜组织的蛋白质鉴定和蛋白质组相关性。（N = 3个生物复制，n = 9个总实验复制每个条件）。(B) 存档的人类大脑皮层块被透明化，所有透明化方法中检测到的具有蛋白质组相关性的蛋白质组的数量与PFA固定块中的数量进行比较。 n = 4个实验重复。(C) vDISCO透明化与新鲜的定量重现性。(D) vDISCO透明化与新鲜样品蛋白质组的异表达（DE）分析，突出了与新鲜样品相比，由于组织透明化的血液灌注步骤，“血液微粒”的预期变化。否则，其他GO组中的蛋白质没有变化。(E) vDISCO透明化样品与新鲜样品之间蛋白质质量分布的百分比变化。百分比变化显示为一组内细胞器、膜和细胞骨架GO术语的中值变化（N = 3 个生物重复，n = 9 个总实验重复每个条件）。另请参见图 S1 和 S2。
2. vDISCO透明化组织中的高蛋白质组产量
接下来，我们检查了vDISCO透明化组织的深入蛋白质组，以研究透明化过程引入的潜在蛋白质消耗，并与新鲜冷冻样品进行比较。我们鉴定了近 8,000 种蛋白质，占总蛋白质组的很大一部分，跨条件和生物复制具有高定量重现性（R = 0.94；图 1C 和 S2A）。新鲜（非灌注）和透明化（灌注和固定）条件下的变异系数(CV)低于 0.2，表明vDISCO透明化产生的蛋白质组在质量和数量上与新鲜组织相似，并且在生物复制中具有高度可重复性（图 S2B– S2E）。 唯一改变的基因本体论(GO)术语是“血液微粒”蛋白质，这并不奇怪，因为没有灌注新鲜组织。其他GO关键字在数量和质量上都得到了保留（图 1D 和 S2F）。 接下来，我们检查了新鲜和vDISC小鼠大脑之间的蛋白质质量分布，以了解膜、细胞器和细胞骨架术语。我们发现所有子项的蛋白质质量差异百分比都远低于 15%，并且与所有膜相关项相关的蛋白质质量变化低于 3%（图1E）。 此外，我们还研究了特定的膜结合蛋白类别，即质膜蛋白。总蛋白质质量变化百分比低于 0.5%。 例如，我们强调了表皮生长因子受体 (EGFR)，一种跨膜受体，介于新鲜和vDISCO透明化的脑样本之间（图 S2G）。 总之，与新鲜组织相比，即使是最强的基于有机溶剂的组织透明化方法vDISCO，也会产生定性和定量上非常相似的蛋白质组。图 S2. 生物一式三份中vDISCO透明化和新鲜小鼠脑组织中蛋白质组和基因本体的定量评估，与图 1 相关(A) 在新鲜或vDISCO透明化组织的所有三个生物复制中鉴定的蛋白质。 (B) 包括新鲜和vDISCO透明化组织在内的总数据集或仅新鲜/vDISCO的变异系数 (CV)。请注意，跨生物复制的CV很低，并且跨生物一式三份的CV对于新鲜和vDISCO非常相似，强调 vDISCO 透明化器官的蛋白质组具有高度可重复性。 (C) 新鲜组织（左；总共7,691种蛋白质；所有蛋白质的54%低于 CV = 0.2）或 (D) vDISCO透明化组织（右；总共7,604种蛋白质；所有蛋白质的 47%）的CV等级图丰度蛋白质低于 CV = 0.2)。 (E) 所有六个生物复制的蛋白质强度相关图（3x新鲜和 3x vDISCO透明化）。 (F) 术语“免疫”（99 种蛋白质）、“伤口愈合”（76种蛋白质）、“病毒宿主”（24种蛋白质）、“神经变性”（9种蛋白质）、“细胞迁移”（498种蛋白质）和“受体”（1,018 种蛋白质）介于新鲜和 vDISCO透明化的生物一式三份之间。 (G) 新鲜和 vDISCO透明化大脑中一种质膜相关蛋白的平均强度差异 (N = 3)。
3. 微解剖组织的蛋白质组 3D 成像
在为溶剂透明化的组织建立高质量且可重复的 MS 兼容样品制备工作流程后，我们转向对先前成像并位于3D中的较小目标组织区域 (约0.0005 mm³) 进行无偏蛋白质组分析。我们成功地遇到了三个主要挑战：（1）可靠地解剖通过透明化组织的3D成像识别的小组织区域，（2）仅从几纳克的解剖和刚性溶剂透明化组织中分析深层蛋白质组，以及（3）注册小组织区域回到完整的3D光片图像堆栈。为了解决第一个挑战，我们开发了一系列步骤来使透明化的刚性组织变软，以进行精确的冷冻切片和激光捕获显微切割 (LCM) 而不会变形。简而言之，我们颠倒了透明化方案，逐步对透明化的组织进行再水化，并将其冷冻保存。该工作流程避免了冷冻切片过程中组织的破裂，并使我们能够激光显微解剖小至 0.0005 mm³ 的组织区域，按体积对应约60个细胞。接下来，我们将样品制备工作流程小型化，然后在改进的捕获离子淌度MS 平台上进行基于MS的蛋白质组分析，该平台专为低至单细胞水平的最高灵敏度而开发。 最后，我们将 2D LCM图像自动配准3D光片成像堆栈（图 2A）。 简而言之，在光片显微镜成像之后，透明化后的小鼠大脑在通过LCM切割之前进行再水化、冷冻保护、切片和成像。这些图像经过对齐（刚性配准）以生成LCM切片的重建3D堆栈。然后将它们逐片协调到光片成像堆栈的一个子集（仿射配准），得分最高的部分随后用于将感兴趣区域 (ROI) 投影到3D光片成像数据上（图2B 和 S3Q；参见方法 S1)。图2. DISCO-MS揭示了轻度创伤性脑损伤（mTBI）在整个大脑离散区域的影响(A) 对齐过程的示意图。(B) LCM切片（轮廓）在光片堆栈内的位置，在视束内有 200 × 200 μm的解剖区域（白色方块）。(C) mTBI后典型CX3CR1-GFP/+ 小鼠大脑的拼接图像的3D重建，突出了沿视束区域激活的小胶质细胞（洋红色）的显著增加。沿视神经束确定了3个相邻的 ROI，进行了激光捕获，并进行了蛋白质组学分析。比例尺，100微米。(D) mTBI中共享和独特的一组蛋白质的数量。(E) PCA 图显示来自mTBI的单个ROI与来自具有相同空间位置的控制（假）的ROI的分布。(F) 火山图显示蛋白质显著富集。(G) 视束中前 2 种蛋白质的组织学验证：(1) 红色的 stathmin (Stmn1) 和蓝色的核标记 Hoechst染料，(2) 洋红色显示的神经聚糖 (Ncan) 以及小胶质细胞标记 (Iba1)绿色和蓝色的 Hoechst染料。比例尺，20微米。(H 和 I) Stmn1免疫染色信号的强度量化（p = 0.007，n = 3来自总共8个部分）和 Ncan免疫染色信号（p = 0.044，n = 3，来自总共11个部分的动物）分别在mTBI与假手术中（未配对的双侧学生 t 检验，数据显示为± SD）。另请参见图 S3、和方法 S1
图 S3. 通过行为和轴突形态验证轻度创伤性脑损伤 (mTBI)模型，与图 2 相关(A) 描述mTBI对完整头骨的影响区域。 (B) 重复mTBI实验小鼠模型的示意图（红点表示每个影响时间点）。 (C) 假与 mTBI动物的巴恩斯迷宫测试。 n = 每组10只动物。 (D) 在假和 mTBI动物中进行光束步行测试。 n = 每组 10 只动物。没有检测到明显的行为变化——证实了我们的 TBI 模型的“温和”性质。 (E) mTBI后典型 CX3CR1GFP+ 小鼠大脑的整合数据的 3D 重建。以洋红色显示的分段小胶质细胞。比例尺，500 微米。 (F) 显示具有激活的小胶质细胞的视束的冠状光学切片的拼接图像。比例尺，400微米。 (G) 艾伦大脑图谱中显示的相应大脑区域（冠状视图）。 (H, J) 来自 (F) 的mTBI大脑中视神经束的高倍放大图像与来自 (I) 的假对照大脑的同一区域显示了与对照大脑相比，mTBI大脑中激活的小胶质细胞形态。比例尺，200 μm，(K) mTBI与假动物中小胶质细胞总数的量化。 (L) 使用 ClearMap方法对mTBI与假小鼠中的小胶质细胞数量进行量化。仅显示有重大变化的区域。 (M) Thy1-GFP-M小鼠mTBI后整个大脑的拼接图像的 3D 视图。比例尺，1000微米。 (N) 显示胼胝体（白质区域）轴突肿胀的缝合图像的 2D 正交切片。比例尺，500微米。 (O, P) (N) 中标记的高倍率图像。比例尺，O，100 μm和 P，50 μm。 (Q) 注册来自同一大脑的光片z平面（左）和 LCM 部分（右）时的潜在障碍概述。图 1：光片荧光产生条纹伪影和不均匀照明。 图 2：在切片过程中，小而松散的结构（例如心室内的脉络丛）会改变形状。图 3：大块组织产生更强的自发荧光，导致例如整个皮质的背景照明不均匀。图 4：在冷冻切片为12 μm切片时，区域可能会撕裂。
为了探索我们的技术在生物应用中的潜力，我们首先使用轻度创伤性脑损伤 (mTBI) 小鼠模型来识别和分析包含离散局部炎症的大脑区域的蛋白质组。 mTBI和脑震荡是常见的损伤，可导致长期病态，例如睡眠障碍、神经精神障碍，甚至早发性痴呆。它们的特点是慢性炎症，可在选定的大脑区域诱发神经退行性变，尤其是沿着伸展的大脑区域。我们在CX3CR1-EGFP小鼠上使用了重复性 mTBI损伤模型（图 S3A 和 S3B），其中所有小胶质细胞都标记有EGFP融合结构。这种损伤的轻微性质通过行为测试得到证实，该测试在巴恩斯迷宫和横梁行走测试中显示受伤后8周后没有显著改变（图 S3C 和 S3D）。CX3CR1-EGFP 小鼠的大脑在受伤后8周进行vDISCO标记和透明化处理，显示整个大脑离散区域的小胶质细胞激活。与假手术动物相比，ClearMap量化识别出在不同脑区具有扩大形态的活化小胶质细胞，尤其是沿着轴突束，包括视束和胼胝体（图 S3E–S3L）。Thy1-GFP-M报告小鼠（仅在神经元中表达 GFP）上的相同 mTBI 损伤模型证实了相同大脑区域的轴突异常（图S3M–S3P）。然后，我们在孤立的ROI上使用 DISCO-MS，包括具有已知空间信息的局部激活的小胶质细胞（图2B 和 2C）。与假对照动物中的相应区域相比，我们分析了小至 0.0005 mm³的视束中的三个ROI，我们对每个ROI量化了多达 1,400种蛋白质。总体而言，我们在mTBI 和假手术的所有 ROI 中发现了 602 种常见蛋白质。比较来自mTBI的ROI，我们发现了一个包含 717 种蛋白质的共享蛋白质组特征，每个ROI都有独特的蛋白质组（图 2D）。主成分分析 (PCA) 将mTBI和控件之间的ROI的蛋白质组分开（图 2E）。有趣的是，几种与轴突损伤和修复相关的蛋白质在不同条件下受到强烈的差异调节。例如，stathmin1（Stmn1；增加32倍）是一种参与微管丝系统调节的蛋白质。它的过度表达已被证明可促进爆炸诱导的mTBI中微管的分解。 Neurocan（Ncan；增加30倍）是一种硫酸软骨素蛋白多糖，参与细胞粘附和迁移的调节，在受伤的大脑中上调。八在 mTBI中独特地检测到蛋白质，包括神经胶质细胞中存在但尚未在 mTBI 中描述的metadherin (Mtdh)。此外，我们在脑损伤的条件下发现了许多之前被发现的蛋白质，他们可以作为阳性对照，以及许多未知的蛋白质，他们在 mTBI 模型中被下调。例如，酸性神经酰胺酶（aCDase，Asah1）是一种与鞘脂代谢和多种疾病有关的酶，他们与培养的神经元的形态缺陷有关，在 mTBI 模型中被下调。我们的数据现在表明它可能参与轴突mTBI 畸形。我们还观察到光道线粒体蛋白的变化，例如酪蛋白水解蛋白酶蛋白水解亚基 (Clpp)，一种线粒体基质蛋白酶，和线粒体融合蛋白2 (Mfn2)，一种参与线粒体融合并有助于维持和运作的线粒体膜蛋白线粒体网络（图 2F）。我们通过免疫荧光进一步验证了Stmn1和Ncan在mTBI脑组织中的富集（图 2G-2I）。我们的数据表明，DISCO-MS 是一种强大的方法，可用于获取具有已知空间位置的异质组织区域的无偏蛋白质组学信息。
4. 使用深度学习进行可扩展且稳健的病理学识别
阿尔茨海默(AD)病理学的早期标志之一是脑实质中淀粉样蛋白(Aβ)斑块的积累。我们预计Aβ斑块的无偏检测，随后使用 DISCO-MS 对其进行同样无偏的蛋白质组分析, 将为AD的初始阶段提供有价值的见解。为此，我们使用AD的5xFAD小鼠模型来识别年轻小鼠大脑中的刚果红标记的 Aβ 斑块。由于这些初始斑块的位置未知，我们开发了一种深度学习 (DL) 方法来快速可靠地识别整个小鼠大脑扫描中的所有Aβ斑块。简而言之，我们的网络架构基于U-Net，这是一种行之有效的生物医学图像分析方法（图 3A）。为了评估我们的分割质量，我们计算了广泛的体素和 Aβ 斑块分割指标。我们用于自动Aβ 斑块检测的DL架构在体积精度 (0.99 ± 0.00)、体积精度 (0.71 ± 0.06) 和表面 (0.94 ± 0.03) 以及每个Aβ斑块的总体Dice分数 (0.89 ± 0.09) 方面表现出高性能。 在使用深度学习对整个大脑中的所有斑块进行分割后，我们将数据登记到艾伦大脑图谱中，以获得超过一千个大脑子区域的区域量化（图 3B）。然后我们将它们分组为主要大脑区域为简单起见，由艾伦小鼠大脑本体定义，并使用brainrender（用于交互式可视化的开源 Python包）可视化疾病早期和晚期每个区域的斑块体积（图 3C 和 3D）图3. 整个5xFAD小鼠大脑中斑块的深度学习分析(A) 3D U-Net 架构，包括层信息和特征大小。(B) 分段的斑块覆盖在分层和随机颜色编码的图谱上，以显示可用的注释区域。(C) 72个区域中每个区域的斑块体积可视化。(D) 27个主要区域子集中每个区域的斑块体积可视化。(E) 6周龄小鼠主要脑区斑块数量的量化 (n = 3, ±SD)。(F) 6个月大小鼠主要大脑区域的斑块数量 (n = 2, ±SD)。(G) 6 周大小鼠（蓝色，n = 3，±SD）和 6个月大小鼠（橙色，n = 2，±SD）中斑块体积的量化。
我们的DL模型在6周大的小鼠大脑中识别出很少的Aβ斑块，并在疾病的后期（6个月大的5xFAD）识别出数千个Aβ斑块，而斑块在5周大时不存在。我们还通过使用抗Aβ单克隆抗体的免疫组织化学方法证实了我们在同一大脑区域的6周龄小鼠中发现的Aβ斑块（图 S4A）。为了比较 6周大和 6个月大的5xFAD小鼠在 1,238 个不同大脑区域中的斑块，我们根据艾伦大脑图谱对72个主要大脑区域进行了分组，并绘制了27个疾病相关区域。一些具有初始斑块的主要脑区是海马后区、延髓、小脑皮层分子层、纤维束、下托区、视觉区和海马结构。下托区和海马后区在疾病后期（6个月）显示出更多的斑块：分别为1,689和10,630（图 3E 和 3F）。我们观察到中脑中最大的斑块（运动相关，3,438 μm³），其次是时间关联区（2,880 μm3）、杏仁核后核（2,450 μm³）和听觉区（2,366 μm³），平均体积介于2,000 μm³和早期3,500 μm³（图 3G）。有趣的是，这些区域的斑块体积在6个月时显著减少，表明斑块形态发生了暂时性变化，这可能是由周围微环境的不良生物效应引起的，也可能在疾病进展过程中引起变化。图S4. 5xFAD大脑中Aβ斑块和DISCO-MS命中的组织学验证，与图4相关(A) 用斑块特异性单克隆抗体（MOAB，绿色）对刚果红斑块进行染色的组织组织学验证。此外，小胶质细胞使用IBA1抗体（白色）染色，细胞核使用 Hoechst染料（蓝色）染色。5xFAD小鼠大脑斑块周围的小胶质细胞激活很明显。比例尺，20微米。 (B) 在6周龄小鼠中使用抗体免疫染色对DISCO-MS在海马区命中S100a11（红色）进行组织学验证。使用MOAB2抗体（绿色）共同标记斑块。 (C) S100a11的强度量化（N =每组 3只动物，共12个部分；不成对的双侧学生t检验；p = 0.0311；数据显示为平均值±SD）。 (D) DISCO-MS的组织学验证命中了5xFAD动物海马区的Thop1（绿色）以及6周龄小鼠的刚果红标记（红色）斑块。比例尺，10微米。
在基于DL识别 5xFAD小鼠模型中的早期Aβ斑块之后，我们从海马区与对照小鼠的相应脑区分离出四个ROI（体积：约0.0005 mm³），并将它们置于基于MS的蛋白质组学中（图4A–4D）。我们比较了大约2,000 种蛋白质的重复，PCA图将ROI与Aβ斑块与对照大脑区域分开（图 4E）。差异表达 (DE) 分析显示，许多特征良好的AD相关蛋白在 5xFAD ROIs 中富集，包括 Aβ 前体蛋白，46,51（增加32倍）和噻吩寡肽酶 1（增加 8 倍）（图 4F）)。除了已知和公认的AD相关蛋白外，52,53我们还在早期 Aβ 斑块中检测到特征较少的蛋白，例如钙结合蛋白家族S100a11的成员。图4. DISCO-MS揭示了AD小鼠模型中的单斑块蛋白质组(A) DISCO-MS的主要步骤。(B) 在5xFAD小鼠大脑的缝合图像中Aβ斑块（红色）的 3D可视化（n = 4个实验复制）。比例尺，500微米。(C) 在 (B) 中标记的区域的放大视图来自海马的 4个不同的 ROI（黄色），每个包含单个斑块，选择并分离用于质谱测量。比例尺，100微米。 (D) 选定ROI 的二维投影。比例尺，100微米。(E) 来自5xFAD的ROI蛋白质组与来自对照的相同区域的PCA图。 (F) 火山图显示显著丰富的蛋白质。(G) 5xFAD 中共享和独特的蛋白质组数量。 (H) 从下托的 2 个子区域选择早期斑块和非斑块 ROI。比例尺，1,000微米。 (I 和 J)：(H)中标记的区域的放大视图。比例尺，100微米。(K) 火山图显示斑块与背侧非斑块区域的蛋白质显著丰富。(L) 在腹侧区域（每个区域 n = 14–20个 ROI）。另请参见图 S4 和 S5。
此外，我们还询问了我们的 ROI 与早期Aβ 斑块的蛋白质组之间的相似程度。具有超过1,200个蛋白质鉴定的斑块每个共有768个蛋白质，定义了早期 Aβ 斑块形成的核心蛋白质组（图 4G）。共享早期 Aβ 斑块核心蛋白质组的丰度等级图揭示了Ywhaz (14-3-3) 和 S100a 蛋白质家族的几个成员。在早期Aβ斑块 ROI 中，我们还发现了许多其他参与 AD 的蛋白质，例如 Mapt 的两种亚型，即 Mapt-4和 Mapt-5，说明了基于MS的蛋白质组学的特异性（图 S5A）。我们的蛋白质组学数据还强调了早期Aβ斑块变异性（图 S5B），这些变异性与充分表征的AD蛋白（Mapt、Tmed10、App）、S100a 家族的蛋白质、肽酶（Thop1、Ppia）、Ywha 家族的蛋白质、和其他结构决定蛋白，包括 Nefm和Map2。最后，我们通过免疫荧光证实了 S100a11和 Thop1 在5xFAD脑切片的早期斑块中的存在，而这些蛋白质在野生型 (WT)小鼠的相应区域中不存在（图 S4B–S4D）。图 S5. DISCO-MS 揭示了AD小鼠模型中时空调节的单斑块蛋白质组，与图 4 相关(A) 单个斑块微环境中核心蛋白信号的排序。 (B) 所选蛋白质和蛋白质家族的 Log10 丰度分布作为其在核心Aβ斑块蛋白质组中的变异系数 (CV) 的函数。动态范围覆盖范围高达四个数量级。 CV表明共享斑块核心蛋白质组的变异性，这些蛋白质组已知在阿尔茨海默氏病中发挥作用。 (C)：早期阶段的主成分分析 (PCA) (D) 火山图显示6w背侧斑块与 6w 腹侧斑块中显著性富集的蛋白质。 (E) 6w和6m区域中共享和独特的差异表达 (DE) 蛋白质集的数量。 (F) 火山图显示6m背侧斑块与6w背侧斑块中显著性富集的蛋白质。 (G) 在6m腹侧斑块与6w腹侧斑块区域。 (H) 后期区域的PCA。 （每个区域 n = 8–10 个 ROI）。 (I)后期斑块区域间富集。
我们接下来将斑块区域与背侧和腹侧下托的相邻非斑块区域进行比较，我们在此处观察到初始斑块形成（图 4H 和 4I）。我们发现在这些早期斑块分离物中有 29 种蛋白质被上调，而 14 种蛋白质被下调。其中，我们发现与囊泡融合、囊泡介导的转运和分泌途径相关的蛋白质发生显著的定量变化（Bnip1、Cpd；两者均增加 >10 倍；Bnip 的 p < 0.0001；Cpd 的 p < 0.05），这是早期 AD 发作的潜在标志物（图 4K）。已知的斑块相关蛋白以特定于区域的方式进行调节，以前仅在AD的后期发现而没有精确的空间位置（图 4L）。例如，据报道，仅在疾病的后期阶段，APP/PS1转基因小鼠中 Manf 的表达增加。Actl6b 通过染色质重塑参与转录激活和选定基因的抑制，并在后期研究中进行了研究。AD期（6-15 个月）。人类Actl6b的突变与智力障碍有关，表明这种蛋白质在包括 AD 在内的早期神经系统疾病中发挥作用。Mbp、Cnp 和 Plp1 与髓鞘的结构完整性及其在年龄相关性AD中的功能有关。除了同一区域早期斑块与非斑块区域中许多显著富集的蛋白质外，我们还发现显著的次区域异质性（图 S5C–S5E）。此外，许多这些蛋白质在这两个次区域中分布独特。这些可能会以特定区域的方式驱动疾病进展，由于技术限制，这一概念迄今为止很少被探索过。接下来，我们以特定区域的方式描述了晚期斑块（6个月）微环境，并将其与早期斑块蛋白质富集进行了比较（图 S5F 和 S5G）。背下托数据显示49种蛋白质显著上调，而21种蛋白质下调。在上调的蛋白质中，我们发现了与 S100a 家族 (S100a13)、补体激活和小胶质细胞吞噬通路（C1qa、C1qb、Itgb）和 tau 蛋白结合（Apoe、S100b、Clu）相关的蛋白质。我们还在后期观察到背侧下托和腹侧下托具有明显的蛋白质组学特征，表明这些斑块周围的蛋白质组景观发生了区域和时间特异性变化（图 S5H 和 S5I）。总之，DISCO-MS使我们能够在3D中精确定位整个大脑的早期和晚期Aβ 斑块，并分析它们的空间蛋白质组学构成。我们在AD中恢复了许多已知的Aβ 斑块标志物以及AD发病机制中特征较少的蛋白质。 我们的数据还表明 S100a、Ywhaz (14-3-3)、囊泡融合和转运、髓鞘功能以及补体系统相关家族成员在早期 Aβ 斑块发育中的显著参与。
5. 通过 DISCO-bot组织提取从大体积样品中提取DISCO-MS
接下来，我们的目标是为更大的样本开发DISCO-MS，包括整个小鼠身体和整个人体器官。 由于LCM的切片/成像对于大规模的大体积样本是不切实际的，我们开发了一个机器人提取系统（名为DISCO-bot），使用活检针分离ROI以进行后续蛋白质组学分析（图 5A）。这需要 (1) 在成像时稳定整个小鼠身体以进行机器人提取，(2) 最大限度地减少提取过程中的活检针偏转，以及 (3) 可以穿透硬组织的活检针。图5. DISCO-bot可在成像时从大型透明样本中进行非破坏性组织提取(A) 机器人提取示意图。(B) 鼠标支架的3D模型。(C) 持针器的3D模型。(D) 在优化的鼠标支架上透明化鼠标。(E) 针固定在针架上。(F) 带密封管心针的活检针。 (G) 带机械臂的显微镜CAD模型。(H) 显微镜和机器人设置的组件，注释为 (1) 光片显微镜，(2) 针固定在针架上，(3) Meca500 6 DoF机械臂，带真空管，(4) 物镜，(5) 样品安装在鼠标支架上，(6) 鼠标支架阶段。(I) Meca500 机械臂。(H 和 I) 在提取前用鼠标在成像室中进行粗略校准。(J–M) 机器人提取示例：(J) 目标选择，(K) 接近目标的针，(L) 在真空下提取目标，(M) 提取区域的评估。另请参见图 S6和方法 S1。
首先，为了稳定样品，我们研究了不同的树脂和琼脂糖浓度以调节床刚度、与透明溶液的相容性和成像，并认为2%的琼脂糖包埋非常适合我们的目的。接下来，我们定制了不同的3D打印鼠标支架适配器和针架，根据它们的强度和力偏转标准，并选择了偏转最小的一个（图 5B–5E 和 S6）。最后，我们测试了内部带有探针的各种尺寸和形状的针头，发现尺寸为 18号 (G) 或 22 G的针头具有良好的穿透力和样品提取精度，不会污染不需要的组织（图 5F；详见 STAR 方法）。我们进一步优化了DISCO-bot以与光片显微镜一起工作（图 5G-5I）。由此产生的DISCO-bot系统允许在成像时从透明化的样本中提取小组织区域，从而为DISCO-MS实现大规模的非破坏性和重复性组织分离（图 5J–5M；参见 DISCO-MS手册作为方法S1)。图 S6. 用于从全身机器人提取的针头和鼠标支架的优化，与图 5相关(A) 使用有限元分析方法迭代开发模型，评估持针器 A 的近似挠度为6.2毫米，(B) 持针器 B为2.6毫米，(C) 持针器 C 为0.8毫米。(D)偏转水平采用颜色编码并绘制，以比较呈现持针器设计的迭代发展。在 A-D 中使用的图像由 ANSYS, Inc. 提供。 (E) 在另一侧，鼠标支架 (E) 的最大偏转水平为3.6毫米，(F) 为1.1毫米，(G) 为0.6毫米，鼠标支架 (H) 为0.2毫米。 (I) 绘制比较呈现鼠标支架设计的迭代开发以提高瞄准精度。 (J) 显示用各种针规尺寸获得的蛋白质组数。请注意，除了我们在生物应用中使用的18G和22G针头（图 6 和 7）之外，我们还可以使用更小尺寸的针头获得 >1800种蛋白质。
为了展示DISCO-bot在我们的DISCO-MS管道中的实用性，我们使用 vDISCO透明化了LysM-eGFP小鼠。我们用碘化丙锭 (PI) 共同标记细胞核以确定 DISCO-bot 提取的ROI。全身成像使我们能够在空间上识别所有 LysM-eGFP⁺ 细胞的位置，这些细胞大多位于骨髓壁龛中（图 6A）。然后我们专注于头盖骨和肩胛骨，这两块骨头具有不规则的3D结构，因此很难用标准的 2D 切片进行研究。我们从顶骨颅骨区域选择了三个ROI，从肩胛骨选择了六个 ROI（三个来自外侧边界 (LysM-eGFP)，三个来自内侧边界 (LysM-eGFP⁺) [图 6B–6E]）。然后使用如上所述的 DISCO-MS流程分析 DISCO-bot 提取的ROI。在颅骨中，我们在所有三个ROI中确定了1,984种蛋白质的共享特征，Pearson 相关系数在 0.72 和 0.76 之间（图 6F 和 6G）。为了验证DISCO-bot提取的精度，我们将我们的结果与新鲜分离的颅骨骨髓细胞的蛋白质组学进行了比较。 58 与分离的颅骨蛋白质组相比，我们在总共2,550个已识别的蛋白质组中发现了约2,200个共享蛋白质，证实了DISCO-bot提取的高精度DISCO-机器人提取。其中，这里发现的七个蛋白质组早些时候显示在新鲜分离的颅骨骨髓中在转录物和蛋白质组水平上表达，这进一步验证了使用机械臂的提取精度（图 6H）。在肩胛骨中，我们在内侧和外侧边界骨中观察到 LysM-eGFP 的明显信号。 PCA 清楚地将两组以及 ROI本身分开，特别是从内侧边界，表明这些提取物之间的区域间和区域内异质性。我们在具有高 Pearson相关系数 (0.88-0.98) 的条件下鉴定了1,250 种蛋白质，并在外侧和内侧边界骨之间发现了764种蛋白质的共同特征，而336种和22种蛋白质是各自区域所独有的（图 S7A-S7C）。差异表达（DE）分析显示十种蛋白质上调，包括与先天性和适应性免疫系统相关的蛋白质，如抗原呈递分子H2-L（MHC 1b类）、B 细胞/T 细胞受体通路相关蛋白和细胞因子信号蛋白，如信号转导子和转录激活子 3 (Stat3)，参与对抗原刺激的炎症反应调节的生物学过程。在33种下调的蛋白质中，有信号体相关蛋白质 (Cops7a) 和与肌动蛋白丝网络形成相关的蛋白质 (Fhod1)（图 6I-6L 和 S7D）。 这些结果表明，在端到端成像后，DISCO-MS可以应用于整个成年小鼠身体，以研究空间分子异质性和多样性生物学。图6. DISCO-bot辅助的DISCO-MS在整个小鼠身体的骨髓壁龛上(A) 透明化和成像后LysM-EGFP小鼠全身的 Stiched 图像 (n = 4)。比例尺，700微米。(B) 提取前整个头部放大到顶叶表面的 stiched 图像的3D可视化。 (C) 右侧肩胛骨的 stiched图像的3D可视化显示提取前的外侧和内侧边界（蓝色 PI，红色 LysM）。比例尺，500微米。(D) 机器人提取后在顶叶表面标记 3个ROI。比例尺，500微米。(E) 标记 6个ROI，提取后 3个位于外侧边界，3个位于内侧边界。比例尺，500微米。(F) 颅骨中共享和独特的一组蛋白质的数量。(G) 颅骨样本之间的Pearson相关性（n = 3个实验重复）。(H) 颅骨中核心蛋白丰度信号的排序。(I) 火山图显示了肩胛骨内侧与外侧边缘显著富集的蛋白质。(J) 热图显示肩胛骨内侧与外侧缘与先天免疫系统相关的蛋白质。(K) 与适应性免疫系统相关的蛋白质。(L) 与肩胛骨骨髓壁龛中的 B 细胞受体/T 细胞受体通路相关。另请参见图 S7 。
图 S7. 来自 DISCO和 SHANEL透明化样本的空间蛋白质组学，与图 6 和 7 相关(A) 主成分分析 (PCA)显示 ROI在肩胛骨骨髓内侧和外侧边界的分布。 (B) 来自 LysM-EGFP⁺和 LysM-EGFP^-的所有 6个 ROI 的蛋白质强度相关图。 (C) 维恩图显示了小鼠肩胛骨内侧与外侧边界中共有和独特的蛋白质。 (D) 显示LysM-EGFP⁺和LysM-EGFP^- 肩胛骨样品中与细胞因子通路相关的蛋白质的热图。 (E) 与人类右冠状动脉斑块与非斑块区域中调节蛋白相关的生物过程术语。 (F) 与调节蛋白相关的细胞成分术语。
6. SHANEL 透明化人类心脏冠状动脉的空间蛋白质组学
接下来，我们在冠状动脉疾病(CAD)中测试了我们的DISCO机器人辅助 DISCO-MS方法。急性心肌梗塞(MI) 是导致心血管死亡的主要原因，是全世界死亡的主要原因。当动脉粥样硬化斑块（主要由脂质和钙化组织组成）在冠状动脉内壁缓慢形成时，就会发生急性心肌梗塞然后突然破裂，导致血栓形成，阻塞动脉，最终阻止血液流向身体的其他部位。单细胞 RNA 测序(scRNA-seq) 技术的最新进展使人们对健康和疾病中的心脏细胞有了更深入的了解，但缺乏精确的空间信息。此外，转录水平可能与蛋白质组数据微弱相关，即使在单细胞中也是如此。我们获得了 PFA 固定的人体心脏，用葡聚糖标记其血管，并使用 SHANEL 人体器官透明化协议透明化整个心脏（图 7A 和 7B）。这很容易沿着同一冠状动脉中没有斑块的区域定位任何大小的钙化动脉粥样硬化斑块。 我们在大斑块相关区域周围提取了六个ROI，从几乎没有斑块相关区域提取了六个ROI，这可能代表同一心脏冠状动脉的早期斑块形成，用于 DISCO-MS分析（图 7C–7F)。 我们在每个ROI中量化了1,300种蛋白质，发现53种下调和6种上调蛋白质（图 7G）。 调节蛋白的系统 GO 术语和通路分析表明肥厚性心肌病、心肌收缩（TPM1、TPM2、MYL2、MYL3、MYH6、MYBPC3、DES）、粘着斑、血液凝固、纤溶酶原激活、血小板聚集、纤维蛋白原复合物、凝血级联（SERPING1、FGA、FGG、FGB、FN1）（图7H、S7E 和 S7F）。 其中一些蛋白质以特定区域的方式进行调节，包括MYH10、MYH11、FGA、FGB和FGG，据报道它们与斑块有关（图 7I）。 此外，我们发现肌球蛋白重链 (MYH8) 上调（2.2 倍，p < 0.05），这是一种在动脉粥样硬化斑块中特征较少的蛋白质。由于最近发现其相关形式MYH10和MYH11作为动脉粥样硬化斑块形成的生物标志物，我们在CAD背景下对MYH8的发现令人鼓舞，并需要进一步研究。我们还观察到乙二醛酶 1 (GLO1)增加了 2.5 倍 (p < 0.01)，这是一种普遍存在的细胞酶，参与甲基乙二醛的解毒，甲基乙二醛是一种糖酵解的细胞毒性副产物，可诱导蛋白质修饰（晚期糖基化终产物，AGEs），氧化应激和细胞凋亡。GLO1和AGEs与衰老和糖尿病的发病机制有关。 一项大规模的荟萃分析表明，参与抗原加工的基因网络与CAD密切相关。该网络的关键驱动因素包括GLO1，它加强了该蛋白在重编程动脉粥样硬化斑块微环境中的潜在作用。我们还观察到碳酸酐酶 6 (CA6) 的显著富集（2.3 倍，p < 0.01），它可能在血管钙化和斑块进展中发挥作用，并且之前与CAD无关。 CA是一组催化二氧化碳可逆转化为碳酸氢盐的同工酶。CA同工酶之前被证明与人类的血管钙化有关。我们进一步发现最近发现的肌球蛋白重链家族（MYH10、MYH11）生物标志物和MYH6的成员存在扰动，MYH6是在晚期动脉粥样硬化斑块微环境。此外，我们观察到MACROH2A.1组蛋白的表达显著降低，这在调节自噬和胆固醇流出方面的研究很少。图7. 冠状动脉粥样硬化斑块的人类心脏透明化、成像和蛋白质组学(A) 透明化前整个人类心脏的图像。(B) SHANEL透明化后的人体心脏图像。比例尺，2毫米。(C) 显示葡聚糖标记的血管（绿色）、作为自发荧光的斑块（金色）的人类心脏部分的拼接图像的3D可视化。比例尺，1,000微米。(D) 在机器人引导提取之前，冠状动脉与动脉粥样硬化斑块相关区域和非斑块区域的拼接图像。比例尺，1,000微米。(E) 提取ROI后冠状动脉的缝合图像，提取点显示为蓝色（斑块区域）和洋红色（非斑块区域）。比例尺，1,000微米。(F) (E) 中标记的分段斑块周围 ROI 的放大视图。比例尺，1,000微米。(G) 火山图显示斑块中显著富集的蛋白质 (ROIs 1-6) 与非斑块区域。(H) 差异调节蛋白的途径富集。(I) 每个 ROI中差异调节蛋白质的热图。

讨论

破译组织异质性对于理解正常生理学和病理过程至关重要。虽然细胞和空间分辨组学技术取得了巨大进步，但是对整个器官和生物体中成像的组织区域进行空间组学分析仍然具有挑战性。

我们通过开发和应用DISCO-MS对通过大样本全景成像识别的小组织区域进行蛋白质组分析、使用AI进行计算机3D重建以及使用机器人技术对大体积组织进行自动微创组织分离来应对这一挑战。使用 DISCO-MS，我们确定了在年轻AD小鼠模型的大脑中受Aβ斑块发生早期阶段影响的大脑区域。大多数初始斑块出现在海马后区域，包括内嗅区域，一些出现在后脑区域，包括脑桥和延髓。我们工作提供的蛋白质组数据可以促进发现针对早期阶段定制的诊断和治疗方法。 AD的干预。未来的研究是有必要的，例如，我们使用的5xFAD小鼠模型和其他广泛使用的模型（例如 3xTg-AD小鼠）之间的时间过程和分子细节可能不同。我们的方法还允许分析人类死后样本以探索临床我们发现的相关性。

早期的研究要么从AD小鼠的裂解全脑中获得蛋白质组学概况，要么仅提供预选大脑区域斑块病理学的平均信息，而没有关于斑块位置的空间细节。此外，其中一些研究是仅在某些孤立的细胞类型或大脑切片上进行，再次缺少整个器官水平的空间环境。最近，人们尝试表征5xFAD小鼠整个大脑中的斑块；然而，这些研究缺乏空间蛋白质组信息。相比之下，我们获得了关于整个大脑中具有已知空间位置的孤立单斑块微环境的蛋白质组学数据。因此，我们提供了与单个斑块相关的分子信息及其空间位置，这对于局部靶向治疗至关重要。

我们的技术在小鼠和人体组织上表现同样出色，产生的定性和定量蛋白质组学数据几乎与未透明化的样品无法区分，即使对于最苛刻的基于有机溶剂的组织透明化方法也是如此。与不同组织和生物体的广泛相容性以及DISCO-MS程序的相对简单性将允许在分子和解剖水平上对不同动物模型与人类样本进行基准测试。

虽然组织透明化可能会去除膜蛋白的脂质铸型，但我们观察到质膜蛋白GO类几乎没有受到影响，这表明DISCO-MS可用于识别药物靶向的表面标记。 除了神经科学，这项技术可能会改变许多其他生物医学研究领域的空间分子研究，包括临床样本。我们已经将 DISCO-MS应用于具有动脉粥样硬化斑块的人类心脏样本，并确定了与CAD相关的分子，例如GLO1、CA6、MYH6 和 MACROH2A.1。SHANEL透明化后，我们快速以 3D方式浏览整个冠状动脉，并精确定位斑块相关区域的空间分布。鉴于我们方法的精度和灵敏度，我们能够分离和分析有和没有病理的邻近组织区域以进行比较。

我们得方法有一个关键优势，即机器人引导的组织提取直接从透明化的组织中分离出来，使其具有可扩展性，因为不需要事先切片和注册。这允许从相同标本中快速简化地分离许多样本，同时保留完整的空间信息，并允许在未来的分析中对同一标本的其他部分进行重新采样。

总之，我们提出了一种空间无偏蛋白质组分析技术，包括整个器官和生物体的完整3D成像数据，能够无偏识别和自动提取感兴趣的组织区域，并包括后续的分子表征。 值得注意的是，此处介绍的DISCO-MS技术在整个器官的标记和溶剂透明化方法中具有通用性。它不仅适用于报告鼠标线，还可以用于没有报告线的地方。在这些情况下，可以针对感兴趣的抗原使用染料和潜在抗体进行深层组织标记，将其作为整个器官成像，并进行基于MS的蛋白质组分析。DISCO-MS应该对拥有存档的溶剂透明化器官和成像数据（其中缺少分子数据）的研究人员非常感兴趣。这种方法将进一步询问以看似随机的方式定位的病理环境的分子基础，以推进复杂疾病的研究。

研究局限性

尽管我们已经证明使用 DISCO-MS能让我们对整个标本进行3D无偏成像后进行无偏蛋白质组分析，但仍需要进一步开发以提取更少的细胞用于下游蛋白质组分析。我们目前的方法适用于低至约60个细胞，并为我们提供了这些细胞及其微环境的平均分子细节。虽然这足以研究斑块异质性等多种生物学问题，但距离单细胞水平还很远。单细胞分辨率对于了解正在研究的生物过程中的细胞组成和细胞相互作用很重要。为了实现这一目标，当前的协议需要针对更小的样本量进行改进，以从透明化的样本中提取亚纳克组织。此外，用于透明化组织的蛋白质组学样品制备可以小型化到单细胞或混合细胞状态的水平，而不会失去蛋白质组学深度。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36563667/

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