科研 |首都医科：循环血浆外泌体的蛋白质组学分析揭示了阿尔茨海默病的新型生物标志物（国人佳作）

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编译：微科盟-李乃康，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读
背景：神经元和星形胶质细胞衍生的外泌体已被确定为筛选阿尔茨海默病（AD）生物标志物的最佳来源。然而，很少有研究关注从AD患者血浆中分离的大量外泌体。这项研究调查了大量外泌体内的蛋白质是否有助于AD的诊断。

方法：通过超速离心收集血浆外泌体。从外泌体中提取蛋白质样品。为了诊断目的，测量了淀粉样蛋白β（Aβ）42和磷酸化tau蛋白（P-tau）181的脑脊液水平。一项先导性研究通过用两个队列（第一组：对照组，20；AD组，20。第二组：对照组56；AD组，58）来建立AD的诊断模型。基于质谱的蛋白质组学技术被用于分析血浆外体蛋白质组。平行反应监测用于进一步确认差异表达的蛋白质。

结果：总共对血浆外泌体中的328种蛋白质进行了定量。其中，31种蛋白质在AD患者中发生了改变，12种蛋白质得到了验证。受试者操作特征曲线分析揭示了六种蛋白质的组合（上调的：含Ig样结构域的蛋白质（A0A0G2JRQ6）、补体C1q亚基C（C1QC）、补体成分C9（CO9）、血小板糖蛋白Ibβ链（GP1BB）、Ras抑制蛋白1（RSU1）；下调：去整合素和金属蛋白酶结构域10（ADA10））具有高准确度区分AD患者和健康对照的能力。线性相关分析表明，这种组合与认知能力显著相关。

结论：血浆外泌体蛋白A0A0G2JRQ6、C1QC、CO9、GP1BB、RSU1和ADA10的组合作为区分AD患者和健康个体的新候选生物标志物。

论文ID

原名：Proteomic profling ofcirculating plasma exosomes reveals novel biomarkers of Alzheimer’s disease译名：循环血浆外泌体的蛋白质组学分析揭示了阿尔茨海默病的新型生物标志物期刊：Alzheimers Research & TherapyIF：8.823发表时间：2022.12通讯作者：贾龙飞通讯作者单位：首都医科大学宣武医院

实验设计

实验结果

阿尔茨海默病（AD）是老年人群中最常见的痴呆类型，影响全球近5000万人。AD是一种衰竭性疾病，会造成相当大的健康、经济和社会问题。尽管其影响巨大，但准确和及时诊断AD仍然具有挑战性。外泌体是从所有类型的细胞中释放的纳米级细胞外囊泡，广泛存在于几乎所有体液中。外泌体含有蛋白质、核酸和其他细胞成分，在细胞间通讯中发挥关键作用。由于外泌体及其成分参与神经系统的各种生理和病理过程，包括神经炎症、突触可塑性和病理分子的传播，因此它们被认为是研究AD发病机制的理想候选者，并有望成为早期诊断和预测AD进展的生物标志物。我们和其他人使用了血浆神经元衍生的外泌体，发现淀粉样蛋白β（Aβ）42、总tau蛋白（T-tau）和磷酸化tau蛋白（P-tau）181以及其他成分可以将AD患者与健康个体区分开来。此外，越来越多的证据表明，AD可能是一种全身性综合征，涉及多个外周器官。在此背景下，需要从大量血浆外泌体中寻找发生变化的蛋白质，以进一步了解AD的发病机制。在此，我们提出了对AD患者和健康对照中循环血浆外泌体的无偏蛋白质组学分析，以全面寻找新的诊断生物标志物。该研究旨在探讨AD患者组和健康对照组循环血浆外泌体的蛋白质组学特征，并确定其诊断能力。

1. 研究对象特征

在数据集1中的40名参与者中，平均年龄为67.5（SD，5.4）岁，20名（50%）为女性。在数据集2的114名参与者中，平均年龄为68.7（SD，6.5）岁，59名（51.8%）为女性。研究参与者的人口统计学和临床特征如表1和表2所示。两组数据集在年龄、性别或教育年限方面没有显著差异。如表1和表2所示，Aβ 42（两个数据集均P<0.001）、T-tau蛋白（两数据集均P<0.001）、P-tau 蛋白181（数据集1:P=0.001；数据集2:P<0.001）、APOE ε4状态（数据集1:P=0.03；数据集2:P<0.001）和简易精神状态检查（MMSE）评分（两数据集中均P<0.001）。

表1和表2.数据集1和数据集2中各参与者的特征统计表年龄，受教育时间和MMSE均为平均值（标准差）。缩写：AD：阿尔兹海默症；Aβ：淀粉样β；APOE ε4：载脂蛋白ε4；MMSE，简易精神状态检测；P-tau：磷酸化tau蛋白；SD，标准差；T-tau，总tau蛋白。*表示与对照组相比，p<0.05。

2.外泌体收集与确认

外泌体样品通过透射电子显微镜（TEM）鉴定。在此展示了来自AD患者（图1A）和健康对照（附加文件2:图S1）的外泌体的代表性TEM图像。蛋白质印记分析显示，外泌体标记蛋白Alix在外泌体样品中高度表达，而上清液中的标记物为阴性（图1B）。这些结果表明，已从血液样品中成功收集了外泌体。检测了所有样本中CD9（图1C）、CD63（图1D）和CD81（图1E）的水平，在AD患者和对照组之间未检测到显著差异。

3. 检测差异表达的外泌体蛋白

在一项样本量相对较小的试点研究中（数据集1），AD患者组和对照组的血液中一共定量到328种外泌体蛋白。根据差异倍数≥1.2或≤0.80，与对照组相比，AD组中15种蛋白质显著上调，16种蛋白质显著下调。与对照组相比，AD组中检测到的31种蛋白质的表达水平如图2所示。

图1.通过透射电子显微镜（TEM）、蛋白质印记、CD9、CD63和CD81确认外泌体A.TEM下观察到的AD患者血浆样品中典型的外泌体囊泡（黑色箭头）。B通过蛋白质印记技术对外泌体表面标记物Alix进行检测。上清液作为阴性对照。C-E外泌体中CD9（C）、CD63（D）和CD81（E）的检测。AD，阿尔兹海默症；NS，无显著差异。
图2.通过热图显示初步研究中15个上调蛋白以及16个下调蛋白通过Log2的对数转化绘制热图，正值表示上调（橙色表示），负值表示下调（蓝色表示）。AD，阿尔兹海默症；A0A075B6R9，可能的非功能性免疫球蛋白κ变体2D-24；B1AHL2，腓骨蛋白1；CC110，含有蛋白110的螺旋结构域；FCN2，纤维胶凝蛋白2；APOL1、载脂蛋白L1；HPTR，结合珠蛋白相关蛋白；KVD30，免疫球蛋白-κ变体2D-30；RSU1、Ras抑制蛋白1；GP1BB，血小板糖蛋白Ibβ链；ALAT2、丙氨酸氨基转移酶2；A0A0G2JRQ6，含Ig样结构域的蛋白质；CO9、补体成分C9；C1QC、补体C1q亚单位C；CO7、补体成分C7；CFAH，补体因子H；ADA10、去整合素和金属蛋白酶结构域10（ADAM10）；IGHA2，免疫球蛋白稳定重α2；KT33A，角蛋白，I型角质Ha3-I；HV428，免疫球蛋白重链变体4-28；HBB，血红蛋白β亚单位；A2MG，α-2-巨球蛋白；A1AG2，α-1-酸糖蛋白2；FA12，凝血因子XII；IGHA1，免疫球蛋白稳定重链α1；KV315，免疫球蛋白-κ变体3-15；A0A087X1J7，谷胱甘肽过氧化物酶；AACT，α-1-抗糜蛋白酶；A0A1W2PR11，HLA I类组织相容性抗原，Cα链；LV321，免疫球蛋白λ变体3-21；HYDIN，脑积水诱导蛋白同系物；A0A087WXI2、IgGFc结合蛋白。

4. 确定差异表达的外泌体蛋白

收集一个样本量较大的验证队列（数据集2），以验证AD患者组和对照组之间差异表达的31种蛋白质。七种上调的（补体C1q亚组分C亚基（C1QC）、补体组分C9（CO9）、补体因子H（CFAH）、免疫球蛋白-κ变体2D-30（KVD30）、血小板糖蛋白Ibβ链（GP1BB）、Ras抑制蛋白1（RSU1）、含Ig样结构域的蛋白（A0A0G2JRQ6））和五种下调的蛋白（α2-巨球蛋白（A2MG），去整合素和金属蛋白酶结构域10（ADA10）、α-1-酸糖蛋白2（A1AG2）、免疫球蛋白稳定重链α1（IGHA1）、免疫球蛋白重链变体4-28（HV428））在数据集2中显著差异表达（图3），我们对12种蛋白质进行了生物信息学分析。GO分析显示，大多数蛋白质参与免疫系统和蛋白质级联激活的调节（附加文件3：图S2A，B），并在不同的细胞过程中作为结合分子发挥作用（附加文件3:图S2A、C）。大多数蛋白质定位于细胞外空间和细胞外囊泡（附加文件3：图S2A，D）。KEGG通路分析表明，蛋白质主要在免疫系统和传染病相关途径中富集，如补体和凝血级联（附加文件4：图S3A，B）。此外，B细胞受体信号通路以及补体和凝血级联与富集通路的连接最紧密（附加文件4：图S3C）。富集的途径与晚发性AD和大脑淀粉样血管病有关（附加文件4：图S3D）。

图3.数据集2中外泌体蛋白的检测阿尔茨海默病（AD）患者的C1QC（A）、CO9（B）、CFAH（C）、KVD30（D）、GP1BB（E）、RSU1（F）和A0A0G2JRQ6（G）升高，AD患者的A2MG（H）、ADA10（I）、A1AG2（J）、IGHA1（K）和HV428（L）降低。AD，阿尔茨海默病；FC，差异倍数。C1QC、补体C1q亚单位C；CO9、补体成分C9；CFAH，补体因子H；KVD30，免疫球蛋白-κ变体2D-30；GP1BB，血小板糖蛋白Ibβ链；RSU1、Ras抑制蛋白1；A0A0G2JRQ6，含Ig样结构域的蛋白质；A2MG，α-2-巨球蛋白；ADA10、去整合素和金属蛋白酶结构域10（ADAM10）；A1AG2，α-1-酸糖蛋白2；IGHA1，免疫球蛋白稳定重链α1；HV428，免疫球蛋白重链变体4-28。

5. 外泌体蛋白的诊断组

使用诊断（AD与对照）作为因变量，使用12种蛋白质作为协变量，开发了逻辑模型来评估上述12种蛋白质的功能，以区分AD患者组与对照组。在调整年龄、性别、教育年限和APOEε4状态后，发现一组共六种蛋白质（上调：A0A0G2JRQ6、C1QC、CO9、GP1BB和RSU1；下调：ADA10）与AD相关。年龄、性别和教育年限从进一步分析中删除，因为它们在逻辑模型中的P值>0.05。AD患者和对照组中六种蛋白质的多重共线性诊断显示，所有限定值均>0.1，VIF<10，特征值>0，条件指数<30，表明六种蛋白质之间不存在显著的多重共同性。为了确定六种蛋白质的诊断能力，通过ROC曲线分析进一步评估逻辑模型的预测值。获得的结果表明，六种蛋白质对AD显示出极好的诊断能力，曲线下面积（AUC=0.978，P<0.001，图4A）显著高于单个蛋白质（AUC=0.627–0.774，图4B），表明六种蛋白质的组合是获得有效诊断所必需的。

6. MMSE值与外泌体蛋白水平的相关性

为了进一步研究AD患者外泌体蛋白水平与认知障碍之间的关系，用AD患者MMSE评分与A0A0G2JRQ6、C1QC、CO9、GP1BB、RSU1和ADA10水平进行了线性相关分析。AD患者的外泌体蛋白水平与MMSE评分之间存在显著相关性（适应性R²=0.563，P<0.001，附加文件1：表S2），而在单个外泌体蛋白和MMSE评分之间仅观察到微弱的相关性（R²=A0A0G2JRQ6，0.193；C1QC，0.207；CO9，0.231；GP1BB，0.176；RSU1，0.148；ADA10，0.125，所有P<0.001，附加文件1：表S2），这意味着六种蛋白的组合具有预测认知障碍的潜力。

图4.阿尔茨海默病诊断组的建立A.六种蛋白质组合的受试者操作特性（ROC）曲线分析。B.12种外泌体蛋白的独立ROC分析。六种蛋白质以粗体显示。AUC，曲线下面积；A0A0G2JRQ6，含Ig样结构域的蛋白质；C1QC，补体C1q亚单位C；CO9，补体成分C9；GP1BB，血小板糖蛋白Ibβ链；RSU1，Ras抑制蛋白1；ADA10，去整合素和金属蛋白酶结构域10（ADAM10）；CFAH，补体因子H；KVD30，免疫球蛋白-κ变体2D-30；A2MG，α-2-巨球蛋白；A1AG2，α-1-酸糖蛋白2；IGHA1，免疫球蛋白稳定重链α1；HV428，免疫球蛋白重链变体4-28。P<0.001（A）或0.01（B）。

讨论

在当前的研究中，我们分析了两个独立的数据集，以研究AD中循环血浆外泌体的蛋白质组学特征。我们发现一组包含六种外泌体蛋白的组合与AD相关。据我们所知，这是首次使用大量血浆外泌体建立AD的诊断模型。它的侵袭性和抗体依赖性较低，因此可广泛用于老年人群的AD筛查。

生物标记物在AD诊断和研究中具有重要作用。血清或血浆在AD诊断中的应用越来越受到重视，因为它具有低侵袭性和相对较低的成本。越来越多的证据支持多种有前途的血液生物标志物，如Aβ42、神经丝轻蛋白、P-tau蛋白181和P-tau蛋白217。在这项研究中，我们通过检测血液中的外泌体蛋白来生成AD诊断小组。无标记蛋白质组学揭示了AD中15种上调和16种下调的外泌体蛋白。PRM进一步证实了12种差异表达的外泌体蛋白质，PRM是鉴定和定量蛋白质的靶向方法，且具有可重复和结果一致性高的优点，已广泛用于多个研究。在12种蛋白质中，6种蛋白质的组合与AD密切相关，可以将AD患者组与健康对照组区分开来。此外，六种蛋白质组合与认知能力显著正相关，使其成为认知能力下降的有效预测因子。我们的发现为AD提供了方便且不依赖抗体的生物标志物。

通过蛋白质组学分析，我们确定了一个含有六种循环外泌体蛋白的组合，这可能是AD的新生物标志物。差异表达的蛋白与几个过程相关：炎症和免疫、凝血以及淀粉样前体蛋白（APP）的蛋白水解过程。在我们的研究中，几种补体相关蛋白的水平升高，这与早期星形胶质细胞衍生外泌体研究的结果一致。有令人信服的证据表明补体系统在AD发病机制中至关重要。例如，C1QC与其他亚基结合产生C1q，这是经典补体途径的起始部分。C1q通过调理作用标记tau蛋白影响的突触，并诱导随后的小胶质细胞吞噬作用。此外，小鼠模型显示，失调的C1q介导的突触修剪、脊柱密度损失与行为缺陷相关，暗示其在炎症过程中的有害作用。然而，C1q对原代培养的神经元应对淀粉样蛋白诱导的毒性具有直接保护作用。总之，这些发现表明C1q在AD发病机制中起着双重作用。另一种补体CO9是膜攻击复合物（MAC）的关键子成分，它在补体介导途径的下游级联中起着重要作用。研究发现，MAC与AD患者大脑中的Aβ斑块和tau蛋白缠结共定位，表明CO9可能与AD发病机制有关。GP1BB是GPIb-V-IX复合物的一个亚基，它是血小板中的跨膜蛋白，是血管性血友病因子（vWF）的受体。vWF在脑血管内皮中大量表达，并与炎症活性增强、促进内皮功能障碍和脑淀粉样血管病病理学相关。因此，上调的GP1BB有可能增强vWF的细胞内信号反应，最终恶化神经毒性。迄今为止，尚未报道RSU1在AD中的生理功能。然而，RSU1与AD发病机制之间存在两种有趣的联系。RSU1抑制c-Jun N-末端激酶（JNK）并增强细胞外信号调节激酶（ERK）的激活。JNK激活与淀粉样蛋白加工相关，而JNK抑制导致aβ42肽水平和总斑块负荷显著降低，神经元数量增加，认知能力增强。此外，ERK途径参与了对氧化应激和Aβ毒性的神经保护。作为一种假设，在AD患者中测得的RSU1水平升高可能反映了对过量aβ负荷的补偿性神经保护现象。唯一下调的外泌体蛋白ADA10，也称为去整合素和金属蛋白酶结构域10（ADAM10），是APP加工的主要α-分泌酶。ADA10不仅在减少aβ肽的产生和缓解AD中的病理损伤方面发挥作用，还可能在减少tau蛋白病理、保护突触功能和促进海马体神经发生方面发挥作用。与我们的研究一致的是，血小板中的ADA10被认为是AD早期诊断的潜在生物标志物。总之，我们的发现确定了一组外泌体蛋白作为AD诊断的准确生物标志物，尽管这些蛋白如何导致该疾病仍不确定，但也增进了我们对该疾病的理解。

局限性

这项研究有几个局限性。首先，这项研究受到其横断面设计的限制。尽管我们证实了一组由六种外泌体蛋白构成的组合可能是AD的一个有前途的生物标志物，但纵向研究更适合评估这些生物标志物的性能。其次，尽管该研究涉及两个独立的数据集，但结果应在其他数据集中进行验证。最后，这项研究不包括患有AD或稳定遗忘性轻度认知障碍患者。因此，尚不清楚我们的方法是否适用于预测从潜伏期到可能患有AD的过程。

结论

总之，我们的研究表明，一组由六种外泌体蛋白构成的组合是AD的潜在血液生物标志物。该研究为理解AD提供了更多的见解，并表明循环血浆外泌体的蛋白质组分析可能有助于AD诊断，值得在独立队列中进一步验证。原文链接：  

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9720984/

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