科研 |国家蛋白质科学中心&青岛大学：一种用于组织细胞外囊泡分离和蛋白质组分析的新集成方法（国人佳作）

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编译：微科盟-张嚣，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

细胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。其广泛地存在于各种体液和细胞上清中，例如血清、尿液、唾液、乳汁、胆汁和其他液体。EV与细胞具有相同的拓扑结构，并包含各种生物学上重要的分子，包括蛋白质、RNA和DNA。同时EV在生物过程中的信息交流方面发挥着重要作用，特别是在癌症的发生和发展中。值得注意的是，EV的表征已经从体外细胞培养上清液的研究发展到最近的体内研究，现研究可直接从动物或人体体液（例如血浆、尿液和唾液）中分离EV。EV不仅在循环系统中大量存在，也大量存在于间质组织中，并在细胞间信息交流发挥关键作用。在肿瘤中，间质EV对于调节肿瘤微环境促进细胞定植和转移生长至关重要。与从细胞培养物中获得的EV相比，直接从组织中分离的EV在组织特异性和与微环境的密切相关性方面表现出巨大优势。因此，迫切需要从实体组织标本中提取EV的优化技术，以便能够对肿瘤EV进行体内研究并深入探索其潜在的生物学机制。

肝细胞癌（hepato cellular carcinoma，HCC）是世界上第三大常见的癌症，占原发性肝脏肿瘤的85-90%。HCC 细胞可以通过释放EV来干扰不同类型细胞的生物学行为，如分泌EV来调节微环境中的上皮细胞间质转型（EMT），将周围环境转变为炎症状态，也可与邻近的肿瘤细胞协调以增加侵袭性，并诱导邻近的成纤维细胞和巨噬细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。此外，HCC释放的EV可能会干扰免疫细胞和内皮细胞，从而诱导免疫逃逸和血管生成。HCC分泌的EV还可影响信号通路和调控参与细胞间相互作用的调节因子。几项研究表明，差异表达的EV miRNA可以用作诊断HCC的生物标志物。此外，EV miRNA和lncRNA的递送可能会显著抑制癌症的发展，因此EV成分是HCC的潜在诊断标志物和治疗靶点。

从肝组织或任何其他组织中分离Evs难点在于既要在最大限度地减少细胞破坏，但又要适当地破坏组织。因此为了增加EV纯度，同时减少细胞污染，可能会实施一个或多个EV分离步骤。以前发表的方法依赖于组织匀浆和过滤，这可能会破坏细胞结构，并将细胞内囊泡与EV混合。目前的EV分离方法包括超速离心、沉淀试剂盒、免疫亲和方法、尺寸排阻色谱（SEC）和超滤。然而超速离心耗时，且重复离心可能会导致EV损失，导致产量和回收率有限。试剂盒沉淀方法主要基于聚合物沉淀，但提取的EV纯度相对较低，引入的聚合物也很难去除，可能会对下游分析造成严重干扰。SEC虽显示出良好的回收率和重复性，但纯化柱的尺寸限制了样品的数量和该方法的载量，此外洗脱步骤稀释样品，会导致最终产物浓度低。免疫亲和方法通过抗体和EV膜蛋白之间的特异性相互作用分离EV，但很大层度取决于抗体的性能，因此EVs的回收是不可预测的，且成本相对较高。

在本报告中，作者基于两步法，通过EV提取试剂盒与TiO₂微球相结合，建立了一种从肝组织中分离EV的新方法。该方法首先采用试剂盒法去除组织中的水性成分和复杂成分，然后利用和EV脂质双层上的磷酸基团与TiO₂之间的特异性相互作用提取组织Evs，并就分离到EV的大小、形态和蛋白质组学特征进行了表征。与先前报道的方法相比，蛋白质印迹和蛋白质组学分析表明，分离的EV的纯度和数量明显提高。此外作者也成功地将该方法应用于HCC样本的分析。总共发现了25种显著上调的蛋白质，其中11种与肝癌相关，这表明了本次所提出的组织Evs分离的新方法在癌症研究中是极具潜力的。

论文ID

原名：A new integrated method for tissue extracellular vesicle enrichment and proteome profiling译名：一种用于组织细胞外囊泡分离和蛋白质组分析的新集成方法期刊：RSC AdvancesIF：4.036发表时间：2022.12通讯作者：秦伟捷通讯作者单位：国家蛋白质科学中心&青岛大学

实验设计

实验结果

作者纯化EV的方法是将EV提取试剂盒与TiO₂微球相结合使用。首先使用纯化试剂盒对组织EV进行粗分离，以去除水性成分并降低组织液的复杂性。然后，通过利用EV磷脂双层上的磷酸基团与TiO₂之间的相互作用进一步分离EV。由于脂质双层的柔韧性，可使得TiO₂微球和EV之间实现强烈的多位点相互作用。

由于EV的浓度相对较低，TiO₂微球难以捕获粗组织液中的所有EV。此外，组织液中任何具有磷脂双层结构的成分都倾向于与TiO₂微球结合，从而干扰EV分离。因此，在这项工作中开发了提取试剂盒来进行粗提取，再进行基于TiO₂分离的组合，以从组织中分离高纯度的EV（图1）。

图1. kit-TiO ₂微球法分离EVs的工作流程

1.分离EV的表征

为了表征分离到的EV，作者将使用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）对kit-TiO₂分离方法与传统分离方法进行了比较。如图2A所示，TiO₂微球在与组织液样品孵育前显示出干净光滑的表面，直径均匀为5 μm。与试剂盒提取的组织液样品孵育后，TiO₂微球表面布满大量圆形囊泡（图2B）。随后利用TEM对微球表面附着的囊泡进行了进一步的表征，结果如图2C所示，TiO₂微球表面存在大量的囊泡。在碱性条件下（pH 10-12），磷酸基团与TiO₂微球之间的配位结合被破坏，作者利用10%的氨水来洗脱富集的EV，并进行TEM和纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），洗脱后观察到完整的圆形囊泡结构（图2D）。该结果表明在分离和洗脱过程中均可保留脂质双层。

图2. TiO₂微球分离的EV（A）SEM图像结果；（B）TiO₂微球与试剂盒提取的组织EV共孵育后的SEM图像；（C）吸附在TiO₂微球上的组织EV TEM图像；（D）通过kit-TiO₂方法分离的EVs的TEM图像，红色箭头所指；（E）用不同方法分离并由NTA测量的EV的大小分布；（F）通过NTA测量不同提取方法的EV浓度，n=3；（G）通过BCA蛋白测定不同分离方法获得的EV的总蛋白量，n=3;（H）三种不同的分离方法提取的EV标记蛋白肿瘤易感基因101（TSG101）、溶酶体相关膜蛋白-3（CD63）和多配体聚糖结合蛋白1（syntenin-1）的蛋白质印迹，包括仅使用提取试剂盒、仅使用TiO₂和提取试剂盒与TiO₂的结合；（I）提取的肝组织EV和肝组织匀浆中细胞干扰蛋白电压依赖性阴离子通道（VDAC）、钙联接蛋白（Calnexin）和GM130的蛋白质印迹分析；（H+I）每条泳道上样20 μg蛋白质。

作者对洗脱的EV进行了 NTA粒度、数量分析和蛋白质定量（BCA）。如图2E所示，NTA分析了通过三种方法分离的EV的粒度分布。使用Kit-TiO₂、仅试剂盒和仅TiO₂方法提取的EV的平均粒径分别为175.9 nm、192.6 nm和239.2 nm。仅使用试剂盒和仅使用TiO₂的方法提取的EV显示出具有多个峰的广泛分布的囊泡，然而使用kit-TiO₂方法提取的EV只有一个主峰，表明其粒度分布较窄。如图2F和2G所示，通过NTA和BCA蛋白质测定试剂盒测量EV的颗粒数量和蛋白质丰度，结果表明使用kit-TiO₂提取的EVs颗粒浓度明显高于其他两种方法。有趣的是，作者发现使用试剂盒方法提取的EV的蛋白质高于使用kit-TiO₂的方法，一种可能的解释是通过试剂盒方法分离的EV中可能含有更高丰度的污染蛋白。

作者还进行了蛋白质印迹实验以证实上述结果，测定了kit-TiO₂方法、仅使用TiO₂和仅使用试剂盒分离EV的标记蛋白肿瘤易感基因101、溶酶体相关膜蛋白-3和多配体聚糖结合蛋白1。如图2H所示，在通过kit-TiO₂方法分离的EV中，多配体聚糖结合蛋白1和溶酶体相关膜蛋白3的浓度显著高于通过其他两种方法获得的浓度。接下来，作者又进行蛋白质印迹分析以评估提取的EV的纯度。典型的细胞蛋白例如高尔基体蛋白（GM130）、内质网蛋白（钙联接蛋白）和线粒体蛋白（电压依赖性阴离子通道），在肝组织匀浆中检测到高浓度，但在通过组合方法提取的EV样品中却不存在（图2I），表明细胞碎片已被完全清除，分离出的EV具有高纯度。

通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来检查组合方法获得的EV。收集并检查上清液，洗涤缓冲液（第一次洗涤，第二次洗涤和第三次洗涤溶液）和从TiO₂微球洗脱的组织EV。洗涤缓冲液中的蛋白质信号可忽略不计，但在组织蛋白（LHC）和EV蛋白之间检测到显著差异（图3A和B），表明组织细胞和EV之间的异质性。这些结果均表明，通过与TiO₂的结合有效分离了EV。

图3. （A）通过SDS-PAGE（蓝色染色）分离组织EV蛋白，其中EV是通过kit-TiO₂方法分离的；（B）组织EVs蛋白和肝组织蛋白（LHC：肝匀浆胶原酶）的SDS-PAGE分布（每条泳道加载20 μg蛋白）。

为了评估kit-TiO₂分离方法的可重复性，又进行实验测试了三个生物学重复。使用kit-TiO₂分离方法从三个相同的组织液样本中提取 EV。获得的 EV 用 4% SDS 裂解，并收集 EV 蛋白。然后分离到的 EV 蛋白通过 SDS-PAGE 进行表征，结果显示泳道 1、2和3中可重复观察到相似的蛋白质组分布模式，表明kit-TiO₂具有良好的可重复性。

2. 分离方法的最优化

为了进一步提高EV的分离效果，作者研究了TiO₂微球的使用量和EV分离孵育时间对EV分离的影响。使用200 μL组织液作为样本，通过蛋白质印迹法分析了EV分离前后标记蛋白TSG101的丰度，蛋白质浓度基于条带的灰度值进行相对量化，并归一化为最大值。如图4A所示，当使用1 mg TiO₂时，标记蛋白的浓度极低。随着TiO₂微球量的增加，标记蛋白浓度逐渐增强，在20 mg时饱和。这可能归因于TiO₂在高于20 mg的量下在溶液中的分散会不充分。因此从200 μL组织液中分离EV的最佳TiO₂微球量为20 mg。

图4. EV分离实验条件的优化标记蛋白TSG101是根据蛋白质印迹法的灰度进行相对定量的。TSG101的相对浓度是TiO₂的使用量（A）和孵育时间（B）的函数。将蛋白质浓度标准化为最大浓度值。

此外，也评估了组织液与TiO₂微球的孵育时间对EV分离的影响。如前所述，200 μL组织液中TiO₂的最佳添加量为20 mg，然后分别测试了1 min、2 min、5 min、10 min和20 min的不同孵育时间。如图4B结果显示，蛋白质标记物的浓度随着孵育时间的增加而增加，并且在孵育10分钟时饱和。长时间的孵育可能导致EV在TiO₂微球表面上产生不可逆吸附，并导致EV的回收率降低。因此，从200 μL 组织液中分离 EV 的后续实验，使用10 min最为最优的孵育时间。

3. 小鼠肝组织EV的蛋白质组学分析

作者选择小鼠肝组织作为模式组织，并应用了所提出的EV分离方法进行了额EV提取。组织EVs通过kit-TiO₂方法分离并使用质谱法表征。如图5A所示，作者将不同EV分离方法鉴定的蛋白质与现有EV数据库Exocarta中的小鼠EV蛋白质进行了比较。kit-TiO₂方法分离了1317种EV蛋白，而单独使用试剂盒、单独使用TiO₂或目前金标准超速离心法分别只分离到了1135、1036和1166种EV蛋白。通过kit-TiO₂方法分离的EV蛋白最多，表明其在组织EV研究中的优势。进一步比较的结果表明（图5B），使用kit-TiO₂分离方法从小鼠肝组织液中分离出的EV中总共存在1966个蛋白质组，但使用超速离心、提取试剂盒和TiO₂的分离方法分别只获得了1801、1629和1501个蛋白质组。此外，通过kit-TiO₂方法可以分离到使用超速离心（56.8%）、提取试剂盒（60.2%）、TiO₂（63%）的大多数EV蛋白组。除此之外，kit-TiO₂方法不仅有效覆盖了其他三种方法获得的62%的蛋白质，而且还提供了321种不同的蛋白质，这表明其从组织样本中识别EV蛋白质的能力更高。进一步比较表明，只通过kit-TiO₂方法鉴定到的蛋白质丰度低于与其他方法共有的蛋白质，这表明kit-TiO₂法鉴定EV蛋白质的灵敏度更高。通过kit-TiO₂方法在三个重复中的至少两个重复中鉴定出超过84.5%的蛋白质组（图5C），皮尔逊相关系数大于0.83，重复性良好。该结果证明了使用kit-TiO₂方法从组织中提取EVs的方法具有很高的重复性（图5D）。

图5（A）使用超速离心、仅试剂盒、仅TiO2和kit-TiO₂方法分离EV蛋白的Ven图；（B）使用超速离心、提取试剂盒、仅TiO2和kit-TiO₂方法分离到的组织EV中的蛋白质组重叠图；（C）使用kit-TiO₂方法在三个生物学重复中获得的蛋白质重叠；（D）kit-TiO₂分离方法的可重复性评估。

此外，进行基因本体论（GO）分析以鉴定组织EV蛋白的亚细胞位置。肝EV蛋白在细胞成分中的细胞外外泌体条目高度富集，表明该蛋白质具有泡状和胞外性质。重要的是，鉴定的蛋白质与细胞核、高尔基体、内质网或血液微粒无关，表明细胞碎片或其他囊泡的污染可忽略不计。在生物过程类别中，已鉴定的蛋白质组主要与代谢、氧化还原和蛋白质转运过程相关。此外最丰富的分子功能包括poly（A）RNA结合、催化活性和参与细胞间粘附的钙粘蛋白结合。作者进一步对通过四种方法分离的EV蛋白进行基因本体论（GO）分析。在使用kit-TiO2提取的EV中，细胞成分中归类为EV的蛋白质数量明显高于使用其他三种方法提取的EV。该结果证明了kit-TiO₂方法的可靠性和分离效率均更高。

根据对泛素化蛋白中泛素化位点数量分布的统计分析，大多数蛋白质（36%）仅含有一个泛素化位点，其次是具有两个泛素化位点的蛋白质（20%）和三个泛素化位点（12%），含有7个泛素化位点的泛素化蛋白最少（4%）（图3）。

4. 肝细胞癌和健康小鼠组织EV的蛋白质组学分析

EV蛋白质组学特征的表征可能有助于寻找治疗肝细胞癌的治疗靶点。作者使用kit-TiO₂方法提取了HCC和健康小鼠的肝组织中的EV蛋白进行了比较，样本量为3只HCC小鼠和3只健康小鼠。蛋白质组学图谱显示，从健康小鼠和HCC小鼠中分别分离出1176和1083个EV蛋白组（图6A）。对鉴定出两次以上的蛋白质进行多变量统计分析，以筛选两组之间的差异蛋白质，将p <0.01且log2 | FC |>1.5的蛋白质被认为是存在显著差异。正如火山图6B显示，相对于正常组，HCC组中有25种上调蛋白和45种下调蛋白。使用非监督的分层聚类分析进一步分析HCC中的70种差异表达蛋白，结果如图6C所示，HCC和健康组可明显分开，表明差异表达的EV蛋白可用作HCC的生物标志物或治疗靶点。

图6. 来自健康和HCC小鼠的组织EV的蛋白质组学分析（A）两组中所鉴定出的EV蛋白组重叠；（B）组织EV蛋白的火山图；（C）显著差异蛋白质非监督的分层聚类。

此外，作者也研究了存在显著差异蛋白质的生物学功能。在25个上调的蛋白质中，5-氨基咪唑-4-羟酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶（Atic）、Copa、Cont3、Me1、膜联蛋白A3（Anxa3）、Fth1、膜联蛋白A5（Anxa5）、抗增殖蛋白1（Phb1）、乙酰辅酶A酰基转移酶2（Acaa2）、ATPD和Glud1被发现与HCC高度相关。例如，Atic通过在AMPK和mTOR信号通路中发挥作用来帮助HCC生长和迁移。分泌型Anxa3有助于HCC的致瘤、转移和自我更新过程，阻断Anxa3已被报道为肝细胞癌的治疗靶点。此外，以前与其他癌症（乳腺癌和结直肠癌）有关的一些蛋白质也被发现，例如泛素氧化还原酶核心亚基V1（Ndufv1）、肝型糖原磷酸化酶（Pygl）、肌氨酸脱氢酶（Sardh）和铁蛋白轻链1（Ftl1）。因此，组织EV中显著改变的蛋白质可能是诊断HCC的有用标志物。

结论

在这项工作中，作者提出了一种使用kit-TiO₂方法从动物组织中分离EV的新方法。如蛋白质印迹和蛋白质组学结果所示，此方法能获得高质量和高纯度的EV，并且这种方法成功地在HCC样本中鉴定出数十种差异表达的EV蛋白。这种新分离方法为从动物组织中分离获得EV提供了一个强大的工具，对生物标志物的发现和肝肿瘤的诊断提供了帮助。

原文链接：  

https://doi.org/10.1039/d2ra06185f

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