科研│中央民大（一区）：综合转录组学、蛋白质组学和代谢组学确定了参与霍霍巴响应热胁迫的生物过程和代谢途径（国人佳作）

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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读霍霍巴是一种新兴的工业油料作物，具有很强的耐热性。然而，霍霍巴耐热性的分子机制尚不清楚。本研究中结合生理学和多组学技术，研究了霍霍巴叶中与热胁迫反应相关的代谢途径和相关分子机制。研究者通过蛋白质组学和转录组学分析，分别在热胁迫下的霍霍巴叶中总共鉴定出1660个差异丰度的蛋白质和3912个差异表达的基因。GO和KEGG分析表明，蛋白质折叠和分选、光合作用、钙和MAPK信号通路、活性氧清除、能量代谢和碳水化合物代谢与霍霍巴的热胁迫反应密切相关。代谢组学分析表明，99种代谢物的含量发生了显著变化，其中热胁迫下霍霍巴中松二糖、胍丁胺、黄嘌呤、亚麻酸和L苯丙氨酸的含量显著增加。多组学分析表明，半乳糖醇和棉子糖等可溶性糖类和酪氨酸等游离氨基酸通过调节碳水化合物和氨基酸代谢途径，在维持渗透平衡和减轻热胁迫损伤方面发挥着重要作用。本研究确定了霍霍巴中与热胁迫反应有关的关键蛋白质和代谢物，并为耐热作物的种植提供了遗传资源。

论文ID

原名：Integrated transcriptomics, proteomics, and metabolomics identified biological processes and metabolic pathways involved in heat stress  response in jojoba

译名：综合转录组学、蛋白质组学和代谢组学确定了参与霍霍巴对热胁迫响应的生物过程和代谢途径

期刊：Industrial Crops & Products

IF：6.449

发表时间：2022年4月

通讯作者：高飞，周宜君

通讯作者单位：中央民族大学生命与环境科学学院

DOI号：10.1016/j.indcrop.2022.114946

实验设计

结果

1.热胁迫下霍霍巴的表型和生理参数

为了了解霍霍巴对热胁迫的生理反应，研究者将2个月大的霍霍巴幼苗暴露于热胁迫处理并测量了几个生理参数。在热胁迫下，大部分叶片没有观察到显著变化，只有顶部的2片幼叶略有萎蔫（图1A）。REL和MDA是细胞膜损伤的代表指标。霍霍巴叶中的REL和MDA在热胁迫下均显著增加，表明热胁迫导致霍霍巴叶中的细胞膜损伤（图1B，C）。脯氨酸含量是应激反应的常见指标。正如预期的那样，暴露于热胁迫的叶片中脯氨酸含量增加（图1D）。热处理后霍霍巴叶的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素浓度降低，光合作用受到热胁迫的负面影响（图1E）。

图1.热胁迫处理下霍霍巴的表型和生理反应

将2个月大的温室种植植物（28℃和16小时/8小时光周期）转移到两个生长培养箱（相同的光周期）并在35/32℃（白天/夜晚）下培育1天，37/34℃（白天/黑夜）1天，然后在42/39℃（白天/黑夜）再持续5天。CK组的种子在与温室相同条件下的两个生长培养箱中生长。(A)热胁迫下霍霍巴油的表型。CK，对照组；HS，热胁迫组。（B）REL。(C)MDA含量。(D)脯氨酸的含量。(E)叶绿素的含量。每个实验都进行了3个生物学重复，并使用独立的t检验分析了显著性，*，p≤0.05，**，p≤0.01。

图2.热胁迫下霍霍巴叶的蛋白质组学分析

(A)火山图，红色代表上调蛋白质，绿色代表下调蛋白质，黑色代表没有显著变化的蛋白质。(B)与对照组相比，热胁迫组中上调/下调蛋白质的数量。x轴表示上调/下调，y轴表示DAP的数量。(C)GO富集分析。y轴代表DAP的数量，x轴代表GO项目。蓝色条、橙色条和绿色条分别代表生物过程、细胞成分和分子功能。(D)KEGG通路富集分析。y轴代表富集的KEGG途径，x轴代表富集因子。图中圆点的大小表示富集DAP的数量，圆点越大，DAP越富集。

2.热胁迫下霍霍巴叶片的定量蛋白质组学分析

研究者进行了定量蛋白质组学分析以研究霍霍巴叶蛋白质组对热胁迫的反应。SDS-PAGE电泳显示提取的叶蛋白具有较宽的分子量分布，可用于定量蛋白质组分析（图S1a）。通过质谱分析共鉴定出53778条肽段，包括代表5482种蛋白质的47579条独特肽段（表S1）。PCA分析显示CK和HS组是分开的，表明组之间存在显著差异（图S1b）。聚类分析显示，同一组内的蛋白质丰度谱相似，而CK和HS组之间观察到显著差异（图S1c）。

在已鉴定的5482种蛋白质中，与CK组相比，热胁迫霍霍巴叶中有1660种差异丰度蛋白质，包括880种上调和780种下调的DAP（图2B）。1660个DAP被分为3个主要的GO：生物过程、分子功能和细胞成分。对于细胞成分，前3个富集的术语是细胞、细胞部分和细胞器。在分子功能中，3个最富集的术语是结合、催化活性和结构分子活性。对于生物过程，细胞过程、代谢过程和对刺激的反应是前3个富集的术语，研究者还注意到GO术语抗氧化活性得到了富集（图2C）。 

KEGG富集分析表明，内质网中的蛋白质加工、代谢途径和囊泡运输中的SNARE相互作用是前3个富集的代谢途径（图2D）。亚细胞定位显示DAP主要定位于叶绿体（36.5%）、细胞质（24.2%）和细胞核（19%）（图S2a）。最富集的结构域是一些类似TCP-1的伴侣蛋白中间结构域超家族和热休克蛋白，尤其是GroEL和小热休克蛋白HSP20（图S2b）。

蛋白质相互作用网络分析表明，上调的DAPs（差异丰富蛋白质）通过蛋白质-蛋白质相互作用形成一些大网络，这些网络与蛋白质折叠、蛋白质合成、RNA加工、蛋白质分选、蛋白质降解、信号转导和转录调控、DNA复制和细胞骨架有关（图3A）。网络中有大量与蛋白质折叠相关的HSP，例如HSP90.1，它与18个DAP相互作用（图3B）。许多上调的RNA结合蛋白（RBPs）形成了一个大的网络，这些蛋白主要参与RNA剪接和转运，表明RNA加工在霍霍巴对热胁迫的反应中发挥了重要作用（图3A）。下调的DAP形成了3个大网络，这些网络与线粒体和氧化磷酸化、核糖体和蛋白质合成、叶绿体和光合作用有关（图S3）。

图3.热胁迫下霍霍巴叶中上调DAP的蛋白质-蛋白质相互作用网络

(A)所有上调DAP的蛋白质-蛋白质相互作用网络。此处提到的节点信息：查询蛋白质和相互作用物的第一壳（彩色节点），相互作用物的第二壳（白色节点），未知3D结构的蛋白质（空节点），以及一些已知或预测的3D结构（填充节点）。不同的颜色代表不同蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。粉色和蓝色分别代表来自实验数据和策划数据库的已知交互。绿色、红色和深蓝色分别代表来自基因邻域、基因融合和基因共现的预测相互作用。黄色、黑色和浅蓝色分别代表基于文本挖掘、共表达和蛋白质同源性的其他类型的相互作用。最低要求的交互分数是高置信度0.700。最大的网络与蛋白质折叠有关，其次是蛋白质分选，其他网络与蛋白质合成、蛋白质降解、RNA加工、信号转导和转录调控、DNA复制和细胞骨架有关。(B)HSP90.1和18DAP的相互作用网络，线条代表两种蛋白质的相互作用。

图4.热胁迫下霍霍巴叶的转录组学分析

(A)所有已识别基因的热图。(B)所有已识别基因的火山图，红色代表上调基因，蓝色代表下调基因，灰色代表没有显著变化的基因。(C)与对照组相比，热胁迫组中上调/下调基因的数量。x轴表示上调/下调，y轴表示DEG的数量。

3.热胁迫下霍霍巴叶片的转录组学分析

为了分析热胁迫下霍霍巴叶中的基因表达谱，研究者使用Illumina平台进行RNA-seq，共构建并测序了6个cDNA文库，其中3个来自CK组，3个来自HS组，从中对总共31204个基因进行了定量表征（表S3）。聚类分析显示CK和HS组聚类成两个不同的类别，并且同一组内样本的基因表达模式相似（图4A）。

通过比较CK和HS组6个样本的基因表达模式，鉴定出3912个DEG（表S4），其中2119个上调和1793个下调（图4B，C）。10个随机选择的DEG的qRT-PCR分析验证了RNA-seq的结果（图5）。DEG被分配到52个GO类别，包括26个生物过程、14个细胞成分和12个分子功能（表S5）。对于生物过程，细胞过程、代谢过程和对刺激的反应是最具代表性的术语。对于细胞成分，细胞、细胞部分和细胞器是最富集的术语。对于分子功能，结合、催化活性和转运蛋白活性是前3个富集的GO术语。此外，GO术语抗氧化活性得到了富集（图6A）。KEGG分析显示，DEGs被显著分配到122条代谢途径中，排名前3的代谢途径是光合作用、硒化合物代谢、卟啉和叶绿素代谢（图6B）。

图5.qRT-PCR验证

TPM值用作转录组测序的相对表达水平。使用2-^ΔΔCt方法分析qRT-PCR数据。红色表示CK，黑色表示HS。18SrRNA用作内部对照。每个实验包含3个独立的生物学重复和3个技术重复。

图6.DEG的富集分析

(A)GO富集分析。x轴代表DEG的百分比，y轴代表GO项目。深红色柱、浅红色柱和灰色柱分别表示生物过程、细胞成分和分子功能。(B)KEGG通路富集分析。x轴表示DEG的百分比，y轴表示富集的KEGG途径。

4.热胁迫下霍霍巴叶的基因转录组与蛋白质组的联合分析

为了更好地了解霍霍巴对热胁迫反应的分子机制，研究者对转录组学数据和蛋白质组学数据进行了综合分析。1660个DAPs和3912个DEGs的相关分析显示转录组和蛋白质组之间有240个基因/蛋白质相关（图7A），相关系数为0.461（图7B）。 

在240个基因/蛋白质中，211个表现出相似的表达模式，包括90个上调，121个下调，而29个是相反的表达模式（表S6）。蛋白质丰度和基因表达水平之间的不一致可能是由于mRNA的转录后修饰。值得注意的是，在211个基因/蛋白质中存在各种热休克蛋白(HSP)，包括来自HSP70、HSP90和sHSP家族的薮种成员。对相关基因/蛋白质进行GO分析，这些基因分布在45个GO术语，包括22个生物过程、14个细胞成分和9个分子功能。对于生物过程，细胞过程、代谢过程和对刺激的反应是最富集的术语。在细胞成分方面，细胞、细胞部分和细胞器是最具代表性的类别。对于分子功能，结合、催化活性和转运蛋白活性是前3个富集的术语（图S4）。对非生物刺激的反应(GO:0009628)、对温度刺激的反应(GO:0009266)和对刺激的反应(GO:0006950)和对热的反应(GO:0009408)在生物过程GO术语中也得到了富集（图7C)，表明富集的基因在霍霍巴对热胁迫的反应中发挥了重要作用。然后对相关基因/蛋白质进行KEGG富集分析，发现富集途径是内质网中的蛋白质加工、光合生物中的碳固定、卟啉和叶绿素代谢、碳代谢和苯丙氨酸代谢（图7D）。

图7.蛋白质组学和转录组学的整合分析

(A)DAP和DEG的韦恩图分析。浅红色代表DEG的数量，蓝色代表DAP的数量，中间重叠部分代表相关基因/蛋白质的数量。(B)分析DAP和DEG之间的相关性。x轴表示DAP的log₂FC，y轴表示DEG的log₂FC。(C)与生物过程中的热胁迫相关的术语。(D)KEGG富集分析。x轴代表富集因子，表示注释到该途径的基因/蛋白质的数量及其占注释基因/蛋白质总数的比例，左侧y轴代表富集的KEGG途径。

图8.热胁迫下霍霍巴叶的代谢组学分析

(A)所有已识别代谢物的热图。(B)PCA分析。粉色代表对照组，蓝色代表热胁迫组。(C)已识别代谢物的分类。饼图中的不同颜色代表不同的代谢物。(D)富集分析。x轴表示富集因子，表示注释到该途径的代谢物数量及其占注释代谢物总数的比例，左侧y轴表示富集的KEGG途径。

5.热胁迫下霍霍巴叶代谢组学的变化

为全面分析热胁迫期间霍霍巴代谢物含量的变化，对CK组和HS组霍霍巴叶进行代谢组学分析。在霍霍巴叶样品中共检测到638种代谢物，其中351种代谢物的含量减少，287种代谢物的含量增加（表S7）。CK组和HS组之间代谢物的总体分布模式不同，而组内的总体分布模式相似（图8A）。

为了降低代谢组数据的维度并可视化不同样本之间的关系，研究者进行了主成分分析(PCA)。在PCA模型中，前两个主成分可以明显分离，占总变异的79.8%，PCA1占总变异的66.1%，PCA2占总变异的13.7%（图8B）。PCA1和PCA2的得分图显示了对照组和胁迫组之间代谢模式的显著分离。为进一步探索热胁迫下霍霍巴叶中主要差异积累代谢物的变化和功能作用，采用PLS-DA进行了变量重要性投影（VIP）分析。PLS-DA结果表明，一些代谢物的浓度在热胁迫下发生了显著变化，可以推断出一些变量可以区分对照组和胁迫组（图S5a）。通过分析VIP评分，研究者确定了40种VIP评分≥1的代谢物（表S8），这些化合物中的大多数是氨基酸及其衍生物、类黄酮和生物碱（图S5b，表S8），表明这3种代谢物可能在霍霍巴叶的热胁迫反应中发挥重要作用。

通过比较CK和HS组中每个样品的代谢物浓度，鉴定出99个DAM，包括52个上调和42个下调（表S9），这些DAM可分为12类，包括氨基酸及其衍生物、酚酸和脂质，其中以氨基酸及其衍生物最为丰富（图8C）。KEGG富集分析显示，共有46条代谢途径显著富集。富集的前,3个是氨酰基-tRNA生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及苯丙氨酸代谢（图8D）。KEGG富集分析还显示，一些与碳水化合物合成相关的途径被富集，这些途径包括半乳糖代谢、苯丙烷的生物合成、淀粉和蔗糖代谢。

图9.热胁迫霍霍巴中蛋白质组学、转录组学和代谢组学的综合分析

(A)韦恩图分析。绿色代表DEG，粉色代表DAP，蓝色代表DAM。(B)糖酵解、TCA循环和氨基酸代谢途径。(C)淀粉和蔗糖代谢和半乳糖代谢途径。B和C中节点的位置是代谢物，代谢物旁边的数字表示代谢物的|log2FC=值。红色代表上调，蓝色代表下调。通路编号表示催化相应反应的酶的名称。1.ALDO、FBP、GAPN、GAPDH、PGK、GPI；2.GPMI、GPMB；3.PK、PPDK；4.SERC；5.GLYA6、DLD；7.TAT、GOT1；8.DLAT；9.CSY2；10.IDH3；11、DLD、DLST；12.MDH1；13.GADB；14、SSADH、POP2；15.P5CR；16.PYRB；17.ACAT，SMYD；18.NADB，GOT1；19.NIT2；20.GolS1；21. GALA；22.GALA；23.GALA；24.MALZ；25.MALZ；26.SCRK,GPI。

表1.与DAPs、DEGs和DAMs相关的代谢途径相关的蛋白质或基因。

6.热胁迫下霍霍巴的代谢组、转录组和蛋白质组的综合分析

研究者对转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据集的综合分析表明，37条代谢途径与DAP、DEG和DAM相关（图9A），其中糖酵解/糖异生、三羧酸循环（TCA循环）、氨基酸代谢途径，以及半乳糖、淀粉和蔗糖代谢显著富集（表S10）。

糖酵解/糖异生途径共10个蛋白富集，其中8个蛋白下调，2个蛋白上调。上调最多的蛋白是丙酮酸激酶1(PKP1)，这是糖酵解途径的一种限速酶（表1）。共有参与TCA循环途径有6种蛋白质差异表达，包括4种下调和2种上调。其中一种上调的蛋白质是柠檬酸合酶(CSY2)，它是TCA循环的限速酶（表1）。在本研究中，多种游离氨基酸代谢途径（包括丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸）在热胁迫下的霍霍巴叶中受到显著调控。对于甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径，编码磷酸丝氨酸氨基转移酶(serC)和甘氨酸羟甲基转移酶(glyA)的基因均上调（表1），这与热胁迫下的霍霍巴幼苗中甘氨酸和丝氨酸浓度的降低有关（图9B）。对于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代谢途径，编码酪氨酸氨基转移酶（TAT）的基因显著上调（表1），这与酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸浓度升高有关。对于精氨酸和脯氨酸代谢途径，代谢组学分析表明脯氨酸浓度增加，这与吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)丰度增加有关，P5CR是一种参与脯氨酸合成的酶，正如蛋白质组学分析所示（表1）。对于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，大部分富集基因被下调，包括编码谷氨酸脱羧酶（gadB）、丙酮酸转氨酶（POP2）和琥珀酸-半醛脱氢酶（SSADH）的基因，与相关代谢物的浓度降低，例如谷氨酰胺和天冬酰胺（表1）。对于赖氨酸降解途径，与赖氨酸降解途径相关的两种酶ACAT和SMYD被上调，这与热胁迫下的霍霍巴幼苗中赖氨酸浓度降低有关（表1）。

对于淀粉和蔗糖代谢以及半乳糖代谢途径，编码淀粉合酶（SS3和SS4）的基因下调，编码半乳糖醇合酶（GolS1）和蔗糖合酶（SUS2）的基因上调（表S2，S4），这与热胁迫下的霍霍巴幼苗中半乳糖和蔗糖含量的增加以及淀粉含量的降低有关（图9C）。

7.热胁迫响应的信号转导和转录调控

温度是影响植物生长发育的重要因素之一。近年来，作物产量受到全球变暖和气温上升的负面影响。有必要研究植物的耐热机制，以挖掘潜在的耐热基因用于作物育种，以提高耐热性。霍霍巴是一种新兴的旱地油料作物，对热胁迫具有高度耐受性，但其潜在的分子机制尚不清楚。为了研究热胁迫下霍霍巴的代谢途径和相关基因表达调控机制，本研究进行了整合的转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析。研究结果发现：蛋白质折叠和分选、RNA加工、光合作用、钙和MAPK信号通路、ROS清除、能量代谢和碳水化合物代谢与霍霍巴响应热胁迫密切相关。

环境温度变化首先由质膜上的受体感知，然后通过一系列信号转导途径激活对热胁迫的反应。据报道，热胁迫诱导细胞外钙流入以传递热信号，从而激活拟南芥下游的一系列热胁迫反应。钙依赖性蛋白激酶(CPK)直接结合钙离子并通过磷酸化参与应激信号通路的底物将钙信号传递到各种生理反应中。在本研究中，4种钙依赖性蛋白激酶CPK5、CPK33、CPK21和CPK1在热胁迫后上调（表S2、S4），表明钙信号通路参与了霍霍巴对热胁迫的反应。MAPK级联作为利用磷酸化传递和放大来自钙信号通路的热胁迫信号的关键信号通路，已在小麦、拟南芥和水稻中得到很好的表征。在本研究中，MPK4和MPK13在热胁迫下的霍霍巴中上调（图3A，表S2），表明MAPK级联在霍霍巴传递热信号中起重要作用。

钙信号通路和MAPK级联可以激活下游转录因子来调节植物的热胁迫反应，包括HSF和bZIP家族转录因子。蛋白质相互作用网络分析表明，MPK4和MPK13的下游相互作用蛋白是HY5，一种bZIP转录因子。HY5可以与组蛋白去乙酰化酶HD1相互作用，HD1可以进一步与多种与应激反应相关的靶蛋白相互作用，包括HOS15和XPO1A（图3A，表S2）。XPO1A是一种核转运受体，被证明参与了对热胁迫引起的氧化应激的反应。HOS15是一种WD40重复蛋白，可通过组蛋白去乙酰化调节ABA信号通路和对非生物胁迫的反应。HSFs是调节热胁迫反应的关键转录因子，HSFs通过与HSP基因启动子中的热激元件结合来激活HSPs的表达。在本研究中，3个HSF基因HSFA2、HSFA4和HSFA6B在热胁迫下的霍霍巴中上调（表S4）。据报道，HSFA2和HSFA4分别由拟南芥和毛白杨的热胁迫诱导，HSFA4在热胁迫下激活番茄中的热胁迫相关基因。研究者推测HY5-HD1-HOS15/XPO1A模块和HSF，如HSFA2和HSFA4，可能在调节霍霍巴的热响应中发挥重要作用。

8.蛋白质折叠和分选有助于霍霍巴的热胁迫适应

热胁迫导致蛋白质变性和聚集，与蛋白质合成、折叠、分选和降解相关的大量蛋白质在植物细胞中是差异丰度。本研究定量蛋白质组学分析确定了热胁迫霍霍巴叶中的1660个DAP，其中92个参与蛋白质合成(GO:0006412)，其中43个上调和49个下调，57个参与蛋白质折叠(GO:0006457)，包括53个上调和4个下调，38个参与蛋白质降解（GO：0030163），其中22个上调和16个下调，75个参与蛋白质分选（GO：0016192），其中68个上调和7下调。大多数参与蛋白质折叠和分选的DAP的丰度增加，表明这些生物过程在霍霍巴适应热胁迫中发挥了重要作用。蛋白质相互作用网络分析也支持蛋白质折叠和分类在霍霍巴中响应热胁迫的重要作用（图3A）。 

HSP是蛋白质分子的分子伴侣，在蛋白质折叠和维持适当的蛋白质构象中起关键作用。根据蛋白质的大小，HSPs分为5类，包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSPs。在热胁迫下霍霍巴中观察到多个sHSP丰度的显著变化。sHsps可以识别并结合非天然蛋白质以抑制蛋白质聚集并参与变性蛋白质与其他分子伴侣如HSP70的重折叠。在水稻、匍匐翦股颖和玉米中，热胁迫高度诱导了sHSP基因。在拟南芥、水稻和玉米中过表达sHSP基因的转基因植物增强了对热胁迫的耐受性。在本研究中，多个sHSP在热胁迫霍霍巴中显著上调（表S2），包括sHSP17.6、sHSP20和sHSP21。研究者推测这些sHSP可能作为分子伴侣与热胁迫引起的变性蛋白结合，以防止它们聚集并减少对霍霍巴细胞的损伤。蛋白质相互作用网络分析表明，部分HSP70和HSP90参与了热胁迫下霍霍巴油中叶绿体、线粒体和核糖体的正常功能以及转录起始复合物的稳定性的维持。HSP90.1可以与18种蛋白质相互作用，包括ROF1、TOC64、HOP3、BIP2、Hsc70-1、SGT1B，并且这些DAP在热胁迫下的霍霍巴叶中的丰度增加（图3B）。研究者推测HSP90.1可能通过与TOC64和HOP3的相互作用协助核编码的叶绿体蛋白进入叶绿体，通过与BIP2和Hsc70-1的相互作用维持RNA聚合酶II转录机制的稳定性，并协助HSFA2进入细胞核。通过与ROF1的相互作用激活下游HSR基因。此外，mtHSC70-2可能通过与AR192和MGE1相互作用，帮助核编码的线粒体蛋白进入线粒体和线粒体蛋白折叠，以及Fe-S簇组装。

蛋白质分选是将每个新制备的多肽引导至特定目的地的生物学过程，膜蛋白和分泌蛋白通过内质网高尔基体分泌途径进行分选。在本研究中，88%与蛋白质分选相关的DAP在热胁迫下的霍霍巴中上调，这些DAP参与了囊泡靶向（VAMP711、VAMP726、VAMP724、VAMP714、VAMP713和VAMP727）和囊泡出芽（ARF3和AGD7）。

9.热胁迫下的霍霍巴的能量代谢调节

非生物胁迫常常扰乱植物的能量代谢，能量代谢途径需要重建稳态以适应胁迫条件。在本研究中，葡萄糖含量降低，参与糖酵解途径的10种酶差异丰富，其中丙酮酸激酶PKP1在热胁迫下霍霍巴中上调（表1）。丙酮酸激酶是糖酵解途径的限速酶，增加的PKP1丰度可能促进糖酵解并为各种细胞活动提供更多的ATP和前体。糖酵解产生的丙酮酸可以在TCA循环中被氧化分解。据报道，热胁迫影响p.ostreatus和菠菜中的TCA循环。在本研究中，TCA循环中的6种酶在热胁迫下霍霍巴中的含量差异很大（表1）。在这些酶中，柠檬酸合酶(CSY2)，TCA循环的限速酶，被上调（表S2），而苹果酸，TCA循环中间产物，在热胁迫下霍霍巴中的浓度增加（表S2）。S7)，表明热胁迫下霍霍巴中的TCA循环受到调节。苹果酸参与调节细胞渗透压并对气孔导度和渗透势的变化作出反应。苹果酸浓度的增加可能有助于霍霍巴适应热胁迫。

10.热胁迫下霍霍巴中渗透剂的积累

植物总是通过积累渗透调节物质来缓解热胁迫造成的损害。在本研究中，一些可溶性糖的浓度，包括半乳糖醇、棉子糖、蜜二糖、海藻糖、蔗糖和果糖，在热胁迫下霍霍巴中显著增加（表S7），并且与这一观察结果一致，编码半乳糖醇合酶的基因（GolS1）和棉子糖合酶（DIN10）上调（表S4），并且蔗糖合酶（SUS2）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPS6）的蛋白质丰度在热胁迫霍霍巴中上调（表S2））。值得注意的是，热胁迫下霍霍巴中的淀粉浓度显著降低（表S7）。一方面，热胁迫抑制光合作用并减少淀粉合成。另一方面，更多的淀粉可能在植物中被水解以增加热胁迫下可溶性糖的含量。正如预期的那样，2种淀粉合酶SS3和SS4在热胁迫霍霍巴油中被下调（表S2）。研究者推测霍霍巴可能通过增强GolS1、DIN10、SUS2和TPS6的表达并促进淀粉水解来促进可溶性糖的积累，进而提高细胞的渗透压维持能力，最终增强霍霍巴的耐热胁迫能力。 

游离氨基酸有助于在环境胁迫下维持渗透平衡。在本研究中，热胁迫下霍霍巴叶中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等多种游离氨基酸的含量增加，其中色氨酸是最丰富的氨基酸（图9B）。此外，多胺代谢途径中的4种代谢物胍丁胺、腐胺、精胺和精氨酸的含量在热胁迫霍霍巴中增加（表S7），表明多胺代谢途径可能有助于霍霍巴的热胁迫耐受性。值得注意的是，各种植物中主要的渗透调节剂甜菜碱的含量在热胁迫下霍霍巴中的含量下降。

11.热胁迫霍霍巴对光合作用的抑制作用

光合作用对温度变化非常敏感，据报道，热胁迫抑制了拟南芥、水稻和玉米的光合作用。在本研究中，热胁迫下霍霍巴叶的叶绿素含量显著降低（图1E），DAPs/DEGs的富集分析显示了一些与光合作用相关的代谢途径，包括光合作用、光合生物中的碳固定和卟啉和叶绿素代谢，参与霍霍巴对热胁迫的反应（图7D）。光系统II易受环境胁迫的影响，一些编码光系统II成分的基因，包括PSAO、PSAK和PSAG，在热胁迫的霍霍巴中被下调（表S2，S4）。霍霍巴可能会调整光系统II以适应热胁迫。

热胁迫诱导的过量蔗糖和淀粉可抑制光合作用，但松二糖和异麦芽酮糖不抑制光合作用，并能强烈激活在植物胁迫信号转导中起关键作用的MAPK信号通路。在本研究中，PLS-DA分析表明，热胁迫下霍霍巴中的松二糖和异麦芽酮糖这两种不可代谢的糖的浓度显著增加（表S8）。研究者推测松二糖和异麦芽酮糖可能激活MAPK信号通路来调节霍霍巴油对热胁迫的反应。热胁迫下霍霍巴中2种非代谢糖含量的增加暗示霍霍巴在激活胁迫信号通路的同时可以维持光合作用和生长。

12.其他可能影响霍霍巴对热胁迫反应的因素

热胁迫下植物体内积累过多的超氧自由基、单线态氧、过氧化自由基和羟基自由基，对细胞造成氧化损伤。为了应对氧化损伤，由各种抗氧化酶和小分子抗氧化剂组成的抗氧化系统被激活以去除植物细胞中过量的过氧化物。DAPs的富集分析表明，与抗氧化活性相关的代谢途径参与了霍霍巴的热胁迫的反应（图2C）。一些编码抗氧化酶的基因，包括ATCCS、CUAO和CSD2，在热胁迫下在霍霍巴中上调（表S4），表明这些抗氧化酶促进了ROS清除并保护细胞免受热胁迫霍霍巴中的氧化损伤。此外，据报道，类黄酮可以通过清除辣椒和胡萝卜在热胁迫下产生的ROS来减少损害。在本研究中，通过对DAM的KEGG富集分析富集了类黄酮代谢途径（图8D），表明热胁迫霍霍巴油可能通过增加类黄酮的含量来减少氧化损伤。

霍霍巴是一种雌雄异株植物，雌性和雄性植物的抗逆能力可能存在差异。一项研究报告称，雄性霍霍巴成株比雌性幼苗表现出更高的耐旱性。最近的一项研究表明，与霍霍巴的雌性基因组序列相比，雄性霍霍巴的Y染色体含有额外的应激反应基因。但没有关于雌雄霍霍巴幼苗对非生物胁迫耐受性差异的报道。到目前为止，还没有可靠的方法来鉴定苗期霍霍巴的性别，直到结果期才能根据形态确定植物的性别。在最近发表的关于霍霍巴雄性和雌性基因组的论文中已经确定雄性特异性染色体片段。在未来的研究中，应使用性别特异性引物开发可靠的性别确定方法，并研究雄性和雌性霍霍巴幼苗对热胁迫等胁迫条件的耐受性可能存在差异，以促进对霍霍巴幼苗响应胁迫的分子机制的理解。

图10.霍霍巴对热胁迫反应所涉及的生物过程图

紫色代表代谢物，红色代表上调基因/蛋白质，绿色代表下调基因/蛋白质。当霍霍巴受到热胁迫时，钙内流被激活，热信号被传递到细胞中，MAPK级联反应被触发。MAPK级联进一步放大和传递热信号，激活热响应转录因子，诱导各种下游热响应基因，导致与热胁迫适应相关的多个生物过程发生改变，包括蛋白质折叠和分选、RNA加工、ROS清除、光合作用调节，渗透质积累。

结论

总之，本研究结果通过整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据集，揭示了与霍霍巴热胁迫反应相关的生物过程和代谢途径。多组学分析表明，霍霍巴中的蛋白质折叠和分选、光合作用、钙和MAPK信号通路、自由基清除、能量代谢和碳水化合物代谢受到调节以适应热胁迫。可溶性糖如半乳糖醇、棉子糖和蜜二糖，以及游离氨基酸如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，被积累起来，以维持渗透平衡，减轻热胁迫对霍霍巴造成的损害。研究者构建了一个模型来说明霍霍巴对热胁迫响应的代谢途径和相关分子机制（图10）。本研究确定了与霍霍巴适应热胁迫相关的关键基因/蛋白质和代谢物，并为培育具有更高耐热性的作物提供了遗传资源。原文链接：  https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0926669022004290?via%3Dihub=

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