科研│湖南大学&湖南农大：整合转录组、代谢组和蛋白质组揭示辣椒果发育过程中角质层形成机理（国人佳作）
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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读角质层对于辣椒果的品质具有重要作用，然而，其角质层形成的分子机制尚不清楚。本研究结果表明，辣椒果发育过程中，蜡质不断累积，而角质先增后减，其中十六烷酸和10,16-羟基十六烷酸分别是蜡质和角质的主要成分。研究者整合转录组和蛋白质组研究，提出了辣椒果角质层蜡质和角质聚酯网的形成模式，揭示了参与角质层形成的18对一致表达基因和蛋白；同时筛选出12个脂肪酸生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸延伸、角质、软木脂和蜡质的生物合成、甘油脂代谢和转运途径等方面的关键基因。本研究将为辣椒果角质层形成的分子机制提供重要的候选基因和理论依据。论文ID
通讯作者：丁胜华，王蓉蓉
通讯作者单位：湖南大学，湖南农业大学DOI号：10.1021/acs.jafc.2c04522实验设计
结果与讨论
1.蜡质和角质单体分析
本研究图1B显示了发育过程中辣椒果的蜡质和角质单体浓度。在辣椒果的5个发育阶段，蜡质含量在15.73-59.26μg/cm2之间，各阶段蜡质含量具有显著差异（p＜0.05）。在本研究中，蜡质浓度高于“Vezena Sr Ljuta”辣椒果（13.77μg/cm2），而低于“Ailsa Craig”番茄（324.4μg/cm2），而在不同发育阶段，“MicroTom”番茄的蜡质浓度最高仅为16.36μg/cm2。上述结果表明蜡质浓度与品种关系密切。此外，环境因素如温度、湿度和栽培土壤也是影响蜡质浓度的潜在因素。随着果实发育，辣椒果蜡质逐渐积累，S5阶段较S1增加近3倍。特别是在S2和S4处，蜡质的浓度急剧上升，这与扫描电子显微镜（SEM）的结果一致（图1A）。此外，还观察到辣椒果蜡质呈球形晶体形状。辣椒果发育过程中有两个典型特征:一是果实在S1-S3期间迅速膨胀（平均果长9.9-18.2cm）；二是果实成熟后表皮呈红色并出现微裂纹。辣椒果表皮微裂纹导致果实水分含量显著下降（从92.33%下降到87.87%，p＜0.05），这可能是导致蜡质含量激增的原因之一。由于蜡质具有阻隔水分的作用，可以通过增加蜡质的合成来防止水分的过度流失和果实的开裂。然而，蜡质的合成跟不上果实体积的扩大，导致果实破裂。研究者分析了辣椒果中16种主要的蜡质成分，低浓度和碳链长度低于16的的化合物不进行研究。脂肪酸是辣椒果的主要成分，这与茄科植物枸杞的结果一致。检测到的脂肪酸包括十六烷酸、十八烷酸、顺-9-十六烷酸、十八烷酸、（Z,Z）-9,12-十八烷二烯酸和α-亚麻酸。在S1-S3期间，脂肪酸浓度最高的是十六烷酸和十八烷酸。随着辣椒果生长发育，十八烷酸浓度逐渐降低，但不饱和十八酸浓度迅速增加。（Z,Z）-9,12-十八烯酸和α-亚麻酸在初始未检出，但最后分别增加到14.62和15.60μg/cm2。豆甾醇和β-谷甾醇在各发育阶段均有检测到，而菜油甾醇仅在S1发育阶段检测到。以往的研究表明，辣椒果中含有12α-、β-和δ-香树脂醇；而在本研究中，只有β-香树脂醇在S3、S4和S5被证实，因此推测这与辣椒果的品种有关。
辣椒果发育过程中角质单体总浓度为11.94-138.38μg/cm2，其中S3的浓度是S1的10倍，而在S3到S5期间，角质单体的浓度在逐渐下降。Wang等人还发现角质单体的积累与果实膨大同步进行。“Newhall”脐橙（Citrus sinensis Osbeck）的角质单体浓度在180DAFB时达到最高的233.3μg/cm2，在210DAFB时下降到169.6μg/cm2。此外，杂交醋栗、醋栗和黑茶藨子的角质单体浓度也发生了相同的变化，这可能与叶绿素降解有关。辣椒果变红后，脂肪酸羟基化作用终止，角质单体浓度下降。辣椒果中检出7种角质单体，分别为10,16-羟基十六烷酸、9,10,18-羟基十八烷酸、香豆酸、16-羟基十六烷酸、十六烷二酸、18-羟基-9,12-十八烷二酸和阿魏酸。C16和C18羟化脂肪酸是本研究的辣椒果角质单体的主要成分，也是植物角质单体中最典型的成分。在辣椒果发育的各个阶段，10,16-羟基十六烷酸的浓度最高（6.26-103.67μg/cm2），这与辣椒果、番茄、樱桃的研究结果一致。9,10,18-羟基十八酸浓度次之，为1.05-14.24μg/cm2。此外，香豆酸和阿魏酸也被认为是角质素单体的主要成分和次要成分。
（A）扫描电子显微镜图像（B）蜡质和角质单体在不同发育阶段的浓度阶段。上图为红色框区域放大500倍的SEM图像，下图为红色框区域放大1000倍。不同的字母差异有统计学意义（p＜0.05）。
研究者对S1、S3和S5阶段进行基于参考基因组的RNA-seq测序，共获得62.66G clean reads，每个样品的有效数据量为6.67-7.32G，Q30的百分比为94.91%-95.36%，平均GC含量为42.85%。使用HISAT2对clean reads与参考基因组进行序列比对，每个样本的比对率为95.54%-96.83%。因此，已知的参考基因序列和注释文件可作为数据库。研究者用HTSeq-count软件计算每个样本中蛋白质编码基因的reads counts，用FPKM法计算基因表达量。将与参考基因组比对后得到的reads counts用于PCA和聚类分析，用以观察样本间的相关性和实验数据可靠性。PCA结果（图2A）显示，组间样品分离良好，它代表了不同发展阶段的样本具有差异显著。值得注意的是，PCA1和PCA2的累积方差贡献率达到97.15%，同一组样本的平行性较好，这在聚类分析中也得到了验证（图2B）。此外，不同组间的转录组也有显著变化。显然，S1与S5之间的相关性明显低于S1与S3之间的相关性。基于PCA和聚类分析结果，不可否认的是，S1、S3和S5的基因表达存在显著差异。
研究者采用DESeq2软件对各样本的reads counts进行标准化，计算FoldChange，并采用负二项分布检验来检验显著性差异，只有当q＜0.05和|log2Fold Change|＞1时才能被识别为差异基因（DEGs）。Log2Fold Change＞1为上调基因，Log2Fold Change＜-1为下调基因。如图2C/D所示，研究者从S3 vs S1、S5 vs S3、S5 vs S1三组比较中分别得到4565、6361和8521个DEGs，且DEGs的数量随着辣椒果的发育而增加；此外，在S3 vs S1和S5 vs S3中都上调的DEGs被定义为连续上调基因，而都下调的基因被定义为连续下调基因。S3 vs S1、S5 vs S3共有2257个DEGs，其中连续上调基因317个，连续下调基因907个，先上调后下调基因707个，先下调后上调基因326个，这些均值得关注。
（A）不同发育阶段样品的PCA结果。（B）不同发育阶段样品的聚类分析结果。（C）两组间DEGs上调和下调的数量。（D）不同组间比较的DEGs韦恩图。
研究者通过GO和KEGG富集分析对DEGs进行注释。对于GO富集，S3 vs S1中的3407个DEGs和S5 vs S3中的4791个DEGs分别被注释为236和255个GO术语（p≤0.05）。这些术语主要分为三类:生物过程、细胞组分和分子功能。此外，S3与S1中的857个DEGs和S5与S3中的1331个DEGs分别被注释为28和36个KEGG术语（p≤0.05）。显然，上述DEGs富集在与蜡质和角质合成相关的途径，如苯丙素生物合成、脂肪酸生物合成、角质、苏氨酸、蜡质生物合成、脂肪酸延伸等。为了缩小研究范围，研究者利用GO和KEGG对这些与DEGs相关的通路进行了富集，以便进一步分析。
2.1 参与蜡质生物合成的基因
辣椒果的蜡质主要由烷烃、甾醇、三萜以及饱和和不饱和的C16和C18脂肪酸组成。如图3A、B所示，在脂肪酸生物合成过程、角质、苏氨酸、蜡质生物合成过程、萜类生物合成过程和不饱和脂肪酸生物合成过程中，DEGs显著富集（p≤0.05）。说明调控蜡质合成的基因在S1、S3和S5位点的表达存在显著差异。同样，这些DEGs在KEGG通路中也显著富集（图3C,D），如脂肪酸生物合成、角质、苏氨酸和蜡质生物合成、类固醇生物合成、脂肪酸延伸、不饱和脂肪酸生物合成、油菜素内酯生物合成和萜类骨架生物合成。根据获得的角质层代谢物信息，结合相关KEGG通路基因的表达，筛选出91个DEGs。并进一步分析了脂肪酸生物合成（cann:00061）中的24个DEGs、不饱和脂肪酸生物合成（cann:01040）中的20个DEGs、脂肪酸延伸（cann:00062）中的20个DEGs、角质、亚氨酸和蜡生物合成（cann:00073）中的22个DEGs、苯丙类生物合成（cann:00940）中的7个DEGs、甘油脂代谢（cann:00561）中的4个DEGs。图3E显示了这些DEGs和主要KEGG通路之间的关联网络。
（A）在S3 vs S1和（B）在S5 vs S3中DEGs的GO富集。（C）在S3 vs S1和（D）在S5 vs S3中DEGs的KEGG富集。（E） DEGs与KEGG通路之间的关联网络。相同的颜色表示在相应的KEGG通路和编码蛋白（酶）中富集的DEGs。编码蛋白（酶）的点的大小表明DEGs的富集数量。
在脂肪酸生物合成途径中，C16和C18脂肪酸是在质粒体中从头合成的，它们使用丙二酰辅酶a作为底物，并依赖于脂肪酸合成酶复合体（FAS）的催化进行合成；然后酰基载体蛋白（ACP）上的酰基链每次延长2个碳，经过缩合、还原、脱水、再还原四个步骤的多次循环反应，生成十六烷基-ACP或十八烷基-ACP。最后，由酰基-ACP硫酯酶B（FATB）和酰基-ACP硫酯酶A（FATA）分别释放十六烷酸和十八烷酸。在KEGG脂肪酸生物合成途径中，基因LOC107862897和LOC107875844被富集，分别编码FATB和FATA。需要注意的是，在S3 vs S1中LOC107862897被持续下调，LOC107875844被上调，而在S5 vs S3中DEGs都没有被上调。虽然LOC107862897不断下调，但在辣椒果发育的各个阶段，十六烷酸的浓度仍然持续升高。这种下调不是基因表达的终止，而是基因表达水平的相对降低。因此，只要蜡质的合成量高于损失量（机械损伤等外部环境因素变化的结果），蜡质就会继续积累。此外，代谢物的生物合成与转录组的变化并不同步，即前者滞后于后者。另一个编码FATB的基因LOC107841760为非差异表达基因，但其在S1、S3和S5位点的表达量较高（分别为30.55、49.16和60.00）。这也可能是十六烷酸浓度增加的原因。十八烷酸相对于十六烷酸的浓度下降有两种推测:一是FATA的下调，二是十八烷酸-ACP作为底物催化合成C18:1，C18:2，C18:3。实验中有检测到C18:1，C18:2和C18:3在S3之后积累，而在不饱和脂肪酸生物合成途径中，硬脂酰-ACP去饱和酶（SAD）将十六烯酰-CoA和十八烯酰-CoA氧化为十六烯酰-CoA和十八烯酰-CoA，然后由酰基-CoA硫酯酶水解得到顺-9-十六烯酸和油酸。此外，ω-6脂肪酸去饱和酶（FAD）可将十八烯酰辅酶a进一步氧化为亚麻酰辅酶a，然后氧化为α-亚麻烯酰辅酶a。最终被水解为亚油酸和α-亚麻酸。结合前面的分析，α-亚油酸在S4和S5的蜡质不饱和脂肪酸中占有较高的含量，这在转录组中也得到了证实。研究发现，编码FAD的8个基因在S3 vs S1中上调，S5 vs S1中有1个基因上调，证实了之前对十八烷酸还原的推测。
十六烷酸和十八烷酸可以作为前体参与脂肪酸延伸途径，它们首先在长链酰基辅酶A合成酶（LACS）的催化下形成十六烷酸辅酶A和十八烷酸辅酶A，并进一步运输到内质网（ER）中。然后，在脂肪酸延伸酶（FAE）的催化下，生成极长链脂肪酸（VLCFAs）。FAE是一种与ER结合的多酶复合体，由以下四种酶组成：β-酮酰基辅酶A合成酶（KCS）、β-酮酰基辅酶A还原酶（KCR）、β-羟酰基辅酶A脱水酶（HCD）和烯醇辅酶A还原酶（ECR）。但在两个对照组中，只有KCS和HCD显著富集，其中KCS可能由11个基因编码，HCD可能由3个基因编码。编码KCS的基因中，7个基因（LOC107839042、LOC107845580、LOC107846850、LOC107848214、LOC107848397、LOC107864657、LOC107860042）连续下调，1个基因（LOC107866995）连续上调，1个基因（LOC107873145）先上调后下调，其余2个基因（LOC107858588、LOC107873533）仅在S3 vs S1中下调。同样，2个基因（LOC107851522和LOC107870144）在HCD中持续下调。从上面可以看出，下调是一种普遍趋势。KEGG通路图（脂肪酸延伸途径:cann00062）显示，KCR由LOC107860712编码（表达水平为19.10-32.16），ECR由LOC107851604编码（所有发育阶段均低于0.5）和LOC107870238编码（表达水平为28.41-38.81），但在之前的结果中这些基因并不是DEGs。碳链延伸结束后，长链辅酶A在长链酰基蛋白硫酯还原酶的催化下生成长链醛。最后，在醛脱羧酶（AD）的催化下，一个碳被还原生成奇数个碳的烷烃。结果表明，5个DEGs基因被富集并可能参与AD编码。这些基因的序列与CER1相似，可能是CER1同源基因，其中LOC107844196先上调后下调，LOC107868261持续下调。
2.2 参与角质单体合成的基因
C16和C18羟基脂肪酸是典型的角质单体。在本研究中，10,16-羟基十六烷酸和9,10,18-羟基十八烷酸为角质的主要成分，其合成底物为C16和C18脂肪酸。16-羟基十六烷酸由细胞色素P450家族86亚家族（CYP86A）的脂肪酸ω-羟化酶CYP86A8合成。编码该酶的LOC107879240基因在两组比较中均下调。S5的表达量较S1下降了近99%，在S5仅为0.04。因此，产物16-羟基十六烷酸，以及衍生物16-羟基十六烷酸和10,16-羟基十六烷酸在S3之后下降。16-羟基十六烷酸经酶催化生成十六烷二酸，但该过程中涉及的酶和基因尚不清楚。10,16-羟基十六烷酸由CYP77A生成，其3个编码基因LOC107851237、LOC107859565、LOC107871386的表达与10,16-羟基十六烷酸浓度的变化一致。在S1中，LOC107851237和LOC107871386的表达量分别达到32.48和208.58，然后在S3处下降到6.20和69.26。由于10,16-羟基十六烷酸在S1和S3的高表达，导致其积累。而10,16-羟基十六烷酸在S5时表达量几乎为0，含量下降。生成9,10-环氧-18-羟基十八烷酸有两种途径:一种是通过长链脂肪酸ω-单加氧酶油酸催化生成18-羟基-9-十八烷酸，再通过过氧化酶（PXG）进一步生成9,10-环氧-18-羟基十八烷酸；另一种先由PXG催化生成9,10-环氧硬脂酸，再由CYP94A5催化生成9,10-环氧-18-羟基十八烷酸。PXG的下调基因LOC107838799在S3 vs S1中被富集，3个上调基因LOC107838798、LOC107871079、LOC107879604在S5 vs S3中被富集。可能由于CYP94A5的上调，9,10-环氧硬脂酸并未在角质单体中检测到。最后，9,10-环氧-18-羟基十八烷酸的环氧键被水解生成9,10,18-羟基十八烷酸，但脂肪酸环氧水解酶尚未被鉴定。LOC107875406和LOC107875407参与香豆酸的合成，LOC107875406和LOC107875407在S3 vs S1中上调，LOC107875406在S5 vs S3中下调，这与香豆酸含量的变化一致，此外，阿魏酸在发育过程中先升高后降低。S3 vs S1中有5个基因（LOC107874582、LOC107875336、LOC107862991、LOC107862989、LOC107845577）上调，S5 vs S3中有3个基因（LOC107874582、LOC107875336、LOC107862989）下调，都与阿魏酸合成相关。在ω-羟基棕榈酸O-阿魏酰基作用下，香豆酸和阿魏酰基可与16-羟基十六烷酸反应生成16-对香豆酰基棕榈酸和16-阿魏酰基棕榈酸。脂肪酸被LACS激活成酯酰辅酶A后，在甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）的作用下生成单酰-2-甘油。GPAT4、GPAT6和GPAT8被认为对生产单酰基-2-甘油具有催化活性。Krolikowski等人发现，双敲除GPAT4和GPAT8会导致角质单体减少70%，而过表达GPAT4或GPAT8会导致C16和C18角质单体增加80%。推测LOC107839197和LOC107842762分别编码GPAT4和GPAT6基因，而这两种基因均被持续下调。
3.蛋白质组分析
蛋白提取后，采用TMT标记。研究者通过LC-MS/MS检测和文库检索，共获得420674个二级光谱和82707个有效光谱，鉴定出45310个多肽和6856个蛋白质。根据Score Sequest HT＞0和特有肽≥1的限制性条件筛选可靠蛋白。基于TMT的蛋白质组分析，结果如图4所示。通过t检验计算p值，只有当p＜0.05和|log2Fold Change|＞1时，才能被识别为差异蛋白（DEPs）。研究者分别从S3 vs S1、S5 vs S3和S5 vs S1中获得249、1000和1240个DEPs（图4D）。S1和S3的蛋白表达量均在100以上，S5的蛋白表达量低于100。与S3 vs S1相比，S5 vs S3中DEPs数量明显增加，且下调的DEPs多于上调的DEPs（图4C），与RNA-seq结果一致。这也从蛋白质组学的角度进一步解释了发育后期与果实衰老和水分流失相关的生理变化。总的来说，不同的组具有较大差异，并且组内样本具有较好的平行性（图4A,B）。
与转录组结果类似，DEPs富集在角质、苏氨酸和蜡质生物合成、不饱和脂肪酸生物合成和脂肪酸生物合成KEGG通路中。筛选了20个DEPs，其中9个在脂肪酸生物合成中，4个在不饱和脂肪生物合成中，4个在脂肪酸延伸中，5个在角质层、亚丁基和蜡质生物合成中。这些DEPs进一步解释了辣椒果蜡质和角质的合成。S5 vs S3中富集了15个DEPs，其中10个下调，5个上调。图4E进一步揭示了这些DEPs之间的相互作用。结果发现，A0A2G2Y5S2与A0A2G2ZA47、A0A2G3ADB3和B5LAV8相互作用，并富集在脂肪酸合成KEGG通路中。因此，推测它们可能在机体中相互形成蛋白质复合物，参与脂肪酸的合成。此外，A0A2G2Y6D3可能与A0A2G2YZU4和A0A2G2Y3Y7相互作用，催化羟基脂肪酸的合成，其中，CYP77家族蛋白A0A2G2Y6D3（CYP77A1）和A0A1U8GYB0（CYP77A2）表达下调，这与辣椒果发育后期10,16-羟基十六酸含量的下降是一致的。
（A）不同发育阶段样品的PCA结果。（B）不同发育阶段样品的相关性分析结果（* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001）。（C）两组间DEPs上调和下调的数量。（D）组间比较的DEPs韦恩图。（E）S5 vs S3中与蜡质和角质合成相关的DEPs相互作用。红色表示上调，蓝色表示下调。圆点的大小表示连接的程度。
4. 联合分析
基因与蛋白共表达分布图可划分为9个区域，如图5A所示。c和g区域代表DEGs和DEPs的一致表达结果。图5B中一致表达的DEGs和DEPs数量明显多于图5A。但DEGs和DEPs的表达不一致主要表现为相反表达（a和i区域）或单一差异表达（b、d、f、h区域），这与基因转录和表达在时空上的不一致以及RNA转录后处理机制有关。
研究者对与蜡质和角质合成相关的共表达DEGs和DEPs进行相关性分析（图5C），发现除LOC107864105外，所有基因与其编码蛋白均呈正相关，说明蜡质和角质合成相关蛋白的表达与基因表达基本一致。而且，它们大多表现出极显著的正相关。值得注意的是，脂肪酸延伸和角质、苏氨酸、蜡质生物合成KEGG通路中的DEPs与其编码基因几乎极显著正相关。在辣椒果发育后期，由于调控十六酸和十八酸合成的蛋白下调，相应的代谢物十六酸、十八酸及其羟基衍生物的含量下降；其中蛋白CYP77A1和CYP77A2（A0A2G2Y6D3和A0A1U8GYB0）的下调可能是导致10,16-羟基十六烷酸含量下降的原因，并且其编码基因LOC107851237和LOC107871386为DEGs。
基因和蛋白质在S3 vs S1中的共表达分布（A）和S5 vs S3中的共表达分布（B）。红点（区域c）为共同上调的DEGs和DEPs，绿色点（区域g）为共同下调的DEGs和DEPs，紫色点（区域a和i）为DEGs和DEPs表达相反的结果，蓝色点（区域b、d、f和h）为上调和下调的DEGs或DEPs，灰色点（区域e）为非DEGs或DEPs。（C）与蜡质和角质合成相关的蛋白质和基因的相关热图。红色和蓝色方块表示正常的基因或蛋白质表达水平。
5. 蜡质和角质聚酯网络的形成模式
基于上述结果和KEGG数据库提供的蜡质和角质单体合成途径，图6简要描述了蜡质和角质聚酯网的形成模式。根据Pollard等人的假设，辣椒果的蜡质和角质单体在合成后通过以下4条主要途径转运到细胞外（图6A中的a-d）。（a）蜡质和角质单体可以通过质膜（PM）锚定ER结构域直接到达质膜（PM），随后由ABCG转运蛋白转运。（b）蜡质和角质单体通过细胞质载体蛋白从ER转运到PM。（c）以亲油液滴的形式转运，这种方法可以不通过ABCG转运蛋白直接将物质转运到外膜。（d）通过高尔基体介导的分泌囊泡机制，物质被转运到膜外。蜡质和角质单体的胞内转运机制尚无直接证据，仍需进一步研究。蜡质和角质单体的转运依赖于G家族的ATP结合转运盒（ABC）。ABCG11和ABCG12转运蛋白可形成同型二聚体或异型二聚体用于蜡质的转运。根据以往的研究，ABCG11是一种相当非特异性的转运蛋白，其同型二聚体和异型二聚体都可以转运蜡质和角质单体。然而，ABCG12需要依赖ABCG11才能正常工作。此外，转运蛋白ABCG32显示出10,16-二羟基十六醇-2-甘油的转运活性，这对角质单体的转运至关重要。在本研究中，筛选了8个编码ABCG的DEGs，包括5个编码ABCG11的DEGs,1个编码ABCG12的DEGs和2个编码ABCG32的DEGs。编码ABCG11的两个DEGs（LOC107840060和LOC107870983）先上调后下调。编码ABCG32的LOC107854459持续下调，这与蜡质和角质单体浓度的变化趋势一致。当蜡质和角质单体被转运到细胞外后，脂质转运蛋白（LTP）可能作为直接受体，它是一种在细胞壁中大量存在的非常小的蛋白质，能够与脂质结合并转运到植物表皮。推测LTPG1参与蜡质和角质单体的转运，研究结果中也得到了一系列与脂质运输相关的LTPs，但它们都被GO数据库描述为非特异性脂质转运蛋白，这可能是因为LTPG1和LTPG2都被GO注释为角质层发育和质膜的锚定成分。推据测，它们参与了蜡质和角质单体的膜外转运。编码LTPG1的LOC107852640和编码LTPG2的LOC107875276连续下调，LOC107852640的基因表达结果与蛋白表达结果一致。编码LTPG2的DEGs为LOC107853303和LOC107874558，它们在S3和S1中上调。角质单体被转运至表皮，在脂肪酶的催化下进行聚合反应。到目前为止，只有GDSL型酯酶/脂肪酶蛋白被描述参与了胞外角质层聚合的反应机制，而参与角质聚合过程的其他酶尚不清楚。本文筛选了GDSL的相关编码基因，发现大多数DEGs持续下调。值得注意的是，LOC107855893的基因表达结果与蛋白一致，呈现先上调后下调的趋势。角质聚酯网络形成示意图如图6B所示。由于羟基脂肪酸可以提供羟基和羧基，因此脂肪酸之间通过酯化形成了交联网络。此外，甘油还提供了交联所需的成分。每个酯键都是聚酯网络中的一个重要节点，它们在聚酯网络中起着关键的紧固单元的作用。在所有的辣椒果角质单体中，10,16-羟基十六烷酸的浓度最高，可能是角质聚酯形成的基本单位。
（A）蜡质和角质的合成机理。（B）角质聚酯网络形成示意图。箭头颜色表示代谢物浓度的变化。从白到红表示代谢物浓度逐渐增加，从红到蓝表示先增加后减少。
6.qRT-PCR验证分析结果
基于之前的转录组和蛋白质组分析，研究者从蜡质和角质单体合成相关的KEGG通路中筛选出12个DEGs（LOC107850471、LOC107840373、LOC107873633、LOC107839042、LOC107868261、LOC107851237、LOC107871386、LOC107839197、LOC107842762、LOC107862760、LOC107856237和LOC107854459）进行qRT-PCR验证（图7）。qRT-PCR结果与RNA-seq结果完全一致，这表明基于RNA-seq结果的分析是可靠的。在脂肪酸生物合成KEGG通路中，LOC107850471和LOC107840373被推测为顺-9-十六烯酸和十六烷酸合成的关键基因。特别是LOC107850471的表达与顺-9-十六烯酸含量的变化高度一致。LOC107840373在S1中的高表达表明它可能在十六烷酸的早期合成中发挥关键作用。但在后期基因表达量较低时，十六烷酸仍升高。不可否认的是，LACS有多个关键基因参与编码，如后期上调的基因LOC107864341。在不饱和脂肪酸KEGG途径的生物合成过程中，LOC107873633在后期表达上调，表达量较高，这与（Z,Z）-9,12-十八碳二烯酸的急剧增加趋势一致，因此它是合成该物质的潜在关键基因。在脂肪酸延伸KEGG通路中，KCS编码基因LOC107839042的表达在转录组和蛋白质组中一致，也与qRT-PCR结果一致。在角质、苏氨酸和蜡质生物合成KEGG途径中，烷烃的浓度非常低，与烷烃合成相关的基因LOC107868261仅在S1中高表达，随后显著下降。编码CYP77A的两个基因LOC107851237和LOC107871386的表达与10,16-羟基十六酸浓度的变化密切相关。编码GPAT的两个基因LOC107839197和LOC107842762的表达结果也与之前的结果一致。此外，还筛选了编码ABCG11、ABCG12、ABCG32转运蛋白的基因LOC107862760、LOC107856237、LOC107854459，结果也与预期一致。上述候选基因将在辣椒果育种和开发中发挥关键作用。
原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.2c04522?ref=PDF
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