科研│中国林科院&浙江农科院&三峡大学：整合转录组和蛋白质组分析揭示了伴矿景天对镉胁迫的适应机制（国人佳作）

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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

伴矿景天（Sedum plumbizincicola）是一种镉（Cd）超积累的草本植物，可在地上组织中积累大量的Cd，而不会导致中毒现象。然而，调节该过程的分子机制尚不完全清楚。本研究通过整合转录组和蛋白质组数据，以研究伴矿景天对Cd胁迫的响应机制，并确定可能负责Cd耐受和积累的关键途径。基于串联质谱标签（TMT）的定量蛋白质组分析，研究者共鉴定出630个DAPs（差异丰度蛋白质，以倍数变＞1.5和调整后的p＜0.05作为阈值），这些DAPs富集在包括苯丙素类化合物的生物合成、内质网中的蛋白质加工以及次级代谢物的生物合成的过程中。结合前期转录组学研究，209个基因及其相应蛋白表现出相同的表达模式。这些鉴定出的基因/蛋白揭示了包括苯丙素生物合成、氧化磷酸化、吞噬体和谷胱甘肽代谢在内的几种代谢途径的潜在作用，从而介导了Cd耐受和积累。对过表达筛选出的Cd上调基因SpFAOMT（Flavonoid 3′,5′-甲基转移酶）的转基因株系进行木质素染色和Cd积累试验发现，该转基因株系适应了Cd胁迫，并在Cd胁迫期间，深入了解了伴矿景天中木质素生物合成和Cd积累的作用。

论文ID

原名：Integrative analysis of transcriptome and proteome provides insights into adaptation to cadmium stress in Sedum plumbizincicola

译名：转录组和蛋白质组整合分析揭示了伴矿景天对镉胁迫的适应机制

期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

IF：7.129

发表时间：2022年12月

通讯作者：卓仁英，何正权，吴超

通讯作者单位：中国林业科学研究院，浙江农业科学院，三峡大学

DOI号：10.1016/j.ecoenv.2021.113149

实验设计

结果

1.蛋白质组学分析及差异丰富蛋白质（DAPs）的鉴定

为鉴定Cd胁迫期间伴矿景天中的Cd应答蛋白，研究者对Cd处理0 d（作为对照）或4d的伴矿景天幼苗组织进行基于串联质谱标签（TMT）的定量蛋白质组谱分析（每个处理进行三次生物重复）。研究者共鉴定出6064个蛋白，其中6024个蛋白的定量信息如表S2所示。质谱蛋白质组学数据已通过iProX partner资源库保存到ProteomeXchange Consortium中，数据集标识符为PXD028688（www.iprox.cn）。以倍数变化＞1.5的截断值，校正p＜0.05为阈值，研究者在Cd处理的幼苗根部共鉴定出630个差异丰富蛋白（DAPs）。其中包括289个上调蛋白和341个下调蛋白（图1）。 

对这些DAPs进行GO和KEGG分析注释并分类，研究者发现代谢过程、细胞过程和单生物体过程分别占总DAPs的38.73%、31.27%和22.70%，是生物过程中最大的亚类；细胞、细胞部分和细胞器分别占总DAPs的17.78%、17.78%和11.75%，是细胞组分中最大的亚类；催化活性、结合和结构分子活性分别占总DAPs的39.37%、36.83%和4.44%，是分子功能中最大的亚类（图S1）。在这些DAPs中显著富集的（p＜0.05）GO terms包括“生物过程”中的对氧化应激的响应、单生物体代谢过程和蛋白质复合物的生物合成；“细胞组分”中的蛋白质-DNA复合物、染色质和细胞质；“分子功能”中的过氧化物酶活性、氧化还原酶活性和抗氧化活性（图2）。同时，KEGG通路分析显示，苯丙素类化合物的生物合成、内质网中的蛋白质加工和次级代谢产物的生物合成是这些DAPs最为显著富集的通路（p＜0.05）（图3）。

为了验证DAPs的表达是否与转录变化相关，研究者随机选择了8个基因进行qRT-PCR验证。如S2所示，所有选择的基因在Cd暴露期间与基于TMT标记的蛋白质组实验中鉴定的相应蛋白质丰度的变化一致（表S1），支持蛋白质组学和转录组水平的协调调节作用。

图1.蛋白质组数据的火山图分析（a）及上调或下调的DAP（差异丰富的蛋白）的数量（b）。在火山图中标记了功能表征的关键蛋白。

图2.DAPs的GO富集分析。x轴以z评分的形式计算显示了不同GO terms中的上调或下调趋势。z评分＞0代表GO terms表达上调；z评分＜0代表GO terms表达下调。蓝线以上表示GO terms显著富集；在蓝线以下表示GO terms不显著富集。点的不同大小代表不同GO terms中富集蛋白的数量。

图3.DAPs显著富集的KEGG通路分析。Y轴表示响应的通路，X轴表示富集因子的值。点的大小代表不同GO terms中富集基因的数量。颜色表示p值。

2.蛋白质丰度与基因表达的比较分析

转录组和蛋白质组都是获得基因表达的重要工具，它们反映了转录后调控事件等不同阶段的基因表达。本研究中，研究者从之前发表的伴矿景天根部转录组数据中选择了一部分基因进行了进一步分析，在该研究中，研究者采用了与本研究中相同的伴矿景天幼苗经400 μM CdCl₂处理0 d或4 d（No.SRX9346881）。转录组研究共鉴定出40027个基因，其中35776个基因具有定量信息（表S2）。然后将转录组和蛋白质组数据相结合，获得共享的差异表达基因/蛋白质。根据转录组和蛋白质组研究结果，以倍数变化＞1.5，校正p＜0.05作为阈值，研究者进一步对差异表达基因/蛋白进行筛选。对转录组和蛋白质组表达数据进行鉴定、定量和差异表达三层分析和筛选。在mRNA和蛋白水平共鉴定出6061个基因，其中5900个基因在mRNA和蛋白水平均有表达（表S2）。 

进一步研究者对Cd胁迫下的基因与蛋白质组数据进行了整合分析。基于散点图，研究者探究了转录组基因和来自蛋白质组的蛋白质之间的相关性，其中每个图代表蛋白质与mRNA比值的log2倍数变化。散点图以x和y轴分为9个象限，其中x轴表示蛋白水平倍数变化的阈值，y轴表示mRNA水平倍数变化的阈值。阈值线外的图表示差异表达的蛋白/基因，而阈值线内的点表示无显著差异的蛋白/基因。本研究将5900个具有定量信息的蛋白质/基因划分在9个象限中。第5象限中的2745个基因无论是在mRNA水平上还是在蛋白水平均无显著差异表达。第2和8象限的1013和1356个蛋白在mRNA水平表现出差异表达，但在蛋白水平无差异表达。第4和6象限的188和158个蛋白在mRNA水平未见差异表达，但在蛋白水平有差异表达。第1和9象限的119和112个蛋白在蛋白和mRNA水平上呈负相关关系。第3和7象限的在蛋白质和mRNA水平上均差异表达的84和125个蛋白呈正相关关系。虽然Pearson相关性显示蛋白丰度的倍数变化与转录水平的倍数变化之间呈轻微负相关（r_pearson=-0.095），但象限3和7内的Pearson相关系数表明DEGs之间DAPs的倍数变化呈显著正相关关系（r_pearson=0.796，p＜0.001）。因此，本研究主要集中在象限3和7中共享的差异表达基因，包括它们GO和KEGG的功能分析（图4）。

图4.以散点图的形式表示了mRNA和蛋白水平的9象限分布关系。蛋白质/mRNA的log2比值以蛋白质组/转录组的基因表达倍数变化表示。编号1-9代表象限编号。

3.共享基因/蛋白质的GO及KEGG富集分析

基于GO分析研究者对筛选出的209个共享基因/蛋白进行了功能注释。生物过程中检测到的蛋白所涉及的最大亚类是代谢过程、细胞过程和单生物体过程；细胞组分中最大的亚类包括细胞、细胞部分和细胞器；分子功能中最大的亚类是催化活性、结合和转运蛋白活性（图S3）。共享基因/蛋白显著富集（p＜0.05）的GO terms包括“生物过程”中的对氧化应激的响应、丙酮酸转运和线粒体；“细胞组分”中的线粒体内膜、细胞器内膜和细胞器包膜；“分子功能”中的过氧化物酶活性、氧化还原酶活性（作为受体作用于过氧化物）和抗氧化活性（图5）。 

此外，研究者对共享的基因/蛋白同样进行了KEGG通路分析。在Cd胁迫期间，有4个KEGG直系同源物（KOs）在mRNA和蛋白水平显著上调或下调（p＜0.05），这4个KOs包括苯丙素类化合物的生物合成、氧化磷酸化、吞噬体和谷胱甘肽代谢（表S3）。在苯丙素生物合成途径中，FAOMT和TKPR1表达上调，PER52、形成木质素的阴离子过氧化物酶、PER9、PER3、PER21、PER10、CCR1等表达下调；在氧化磷酸化途径中，PPA4表达上调，CYC1–1、F型H⁺-转运ATP酶、VATG1、NUOB8（NADH-泛醌氧化还原酶B8亚基）和COX6B-2表达下调；在噬菌体通路中，TUBB1和TUBA表达上调，Rab7表达下调；在谷胱甘肽代谢通路中，SPDSYN1表达上调，APX3和IDH表达下调（图6）。 

图5.基于Gene Ontology类别对共享的基因/蛋白进行富集富集。GO terms分为“生物过程”、“细胞组分”和“分子功能”三类主要位于Y轴上，X轴代表不同terms的富集因子。其中点的大小代表不同GO terms中富集基因的数量。颜色代表p值。

图6.Cd胁迫过程下显著富集的KEGG通路中DAPs的热图分析。图中红色表示显著上调的蛋白；蓝色表示显著下调的蛋白。根系中蛋白质的丰度被用于进行归一化和标准化定量。

4.在东南景天（Sedum alfredii）中过表达的SpFAOMT可增加木质素含量

在协调调控的基因/蛋白中，Cd胁迫下SpFAOMT在mRNA和蛋白水平均显著上调，KEGG图谱显示其参与了苯丙素类化合物的生物合成途径（图S4）；同时，前期研究表明苯丙素类化合物的生物合成途径在木质素单体的生物合成中起关键作用，可改变细胞壁结合重金属离子的能力，调节植物的重金属耐受性。因此，选择SpFAOMT进一步分析其在植物耐Cd性及Cd积累中的潜在作用。为了研究SpFAOMT在伴矿景天中的生理作用，研究者基于东南景天（Sedum alfredii，非超积累生态型命名为NHE）生成了35 S::SpFAOMT的转基因株系。选择了SpFAOMT显著高表达的两个转基因株系OE1和OE5进行进一步分析（图S5）。

为了确定过表达SpFAOMT对木质素生物合成的影响，研究者对植株茎部进行了木质素组织化学染色，以测量东南景天SpFAOMT转基因植株中木质素的积累。如图7a所示，用10 μM CdCl₂处理7d后，在茎的表皮和维管组织中发现木质素沉积。与东南景天相比，东南景天SpFAOMT转基因植株的维管染色水平更深，这表明SpFAOMT参与了木质素的生物合成，在东南景天中过表达SpFAOMT可增加木质素含量。

图7.在转基因东南景天中SpFAOMT的功能特征。（a）代表在10 μM CdCl₂处理7d后，SpFAOMT-OE转基因东南景天植株和NHE东南景天植株茎部的木质素染色，其中a中底部的图像代表a是顶部图像中黄色框部分的放大图像；（b）代表对NHE植株和转基因株系（SpFAOMT-OE1和SpFAOMT-OE5）之间的SpFAOMT对植株叶、茎和根中Cd积累的影响。所有植株经10 μM CdCl₂处理7d。以平均值±误差线的形式表示，*代表经统计学检验后，在0.05水平上具有显著性差异。

5.东南景天中过表达的SpFAOMT可减少Cd的积累

为了进一步研究SpFAOMT在Cd耐受和积累中的作用，研究者对2个SpFAOMT转基因株系的叶、茎、根组织中Cd的分布进行了测定。10 μM CdCl₂处理7天后，两个SpFAOMT转基因株系的叶片和茎组织中Cd积累量显著低于东南景天对照组；两个转基因株系的根组织中Cd积累量也略低，但未达到显著水平（图7b）。

讨论

基于先前的研究基础，本研究采用400 μM CdCl₂处理伴矿景天幼苗4天，并以未添加CdCl₂的第0天植株样本作为对照。在重金属胁迫过程中，植株的根部首先暴露于Cd。因此，对植株根部进行转录组和蛋白质组的研究可以直接反映Cd诱导的基因和蛋白质的动态变化。在Cd胁迫过程中利用转录组测序获得了大量的基因。基于TMT标记的蛋白质组定量的蛋白质组变化也鉴定了大量的DAPs。PCA分析证明蛋白质组数据具有良好的可重复性（图S6）。基于qRT-PCR技术研究者对随机选择的8种蛋白的表达趋势进行了测定，其结果与基于TMT的蛋白质组中鉴定的相应蛋白丰度的变化一致，这表明蛋白质组数据的可靠性（图S2）。与先前的研究相比，本研究鉴定出了更多的Cd诱导蛋白，首次将来自伴矿景天的转录组和蛋白质组结合起来，以探究Cd胁迫下的基因调控模型。

植物对重金属胁迫的响应机制主要包括螯合、转运、抗氧化和信号转导，涉及许多转录因子以及诸如转运蛋白在内的下游基因。本研究从蛋白质组中提取的蛋白质为可溶性蛋白质。此外，参与金属离子转运的蛋白为疏水性蛋白。因此，本研究中呈现的转运蛋白含量很低。本研究集中在Cd胁迫期间参与伴矿景天物质代谢和能量代谢的基因/蛋白质组。

基于转录组和蛋白质组鉴定的所有转录本及其相应定量蛋白的表达水平，研究者对所有已获得的数据进行整合分析。如图4所示，在不同的象限中分布着大量的基因。Pearson相关性检验表明转录组与蛋白质组之间的相关性较差，这表明存在广泛的转录后调控以及翻译调控。然而，第3和7象限中的基因在mRNA和蛋白水平上表现出正相关表达模式（r_pearson=0.796，p＜0.001），这意味着基因在转录后和翻译水平上没有被调节或存在较少的调节。对于这组基因的研究可以揭示基因调控的过程和结果，因此对这组基因的分析更可靠。转录组和蛋白质组的相关性分析帮助研究者从伴矿景天中筛选出一组与Cd胁迫相关的基因，这些基因在转录和翻译水平上都受到调控。在共享的基因/蛋白中，显著富集的生物学功能途径主要参与氧化磷酸化、吞噬体、谷胱甘肽代谢和苯丙素生物合成，这与之前的研究一致。植物可以产生和释放次生代谢产物，并与环境相互作用，这意味着存在化感作用，这与重金属胁迫的耐受机制相关。植物通过产生和积累防御性代谢产物进行化感作用，反映了植物对重金属的适应性响应。线粒体作为一种调节有氧呼吸并提供ATP的亚细胞细胞器，对重金属胁迫非常敏感。先前的研究表明线粒体是Cd胁迫的早期靶标。Cd能增加线粒体内膜中H⁺的通透性，阻止植物进行氧化磷酸化。本研究中，研究者确定了一个氧化磷酸化途径，一个主要产生ATP的途径，在该途径中的电子传递链复合物相关基因在Cd胁迫过程中表达上调或下调，这被认为可以增加ATP的产生。细胞的能量代谢可能参与Cd的吸收。暴露于Cd条件下的植物能够产生ROS，而植物在长期进化过程中进化出一种抗氧化防御系统来减少活性氧造成的损伤。谷胱甘肽（GSH）是一种小的抗氧化剂分子，普遍存在于植物中。GSH水平的增加反映了植物对Cd的响应。先前的研究表明APX3在H₂O₂的清除中起着关键的作用。本研究中，APX3在mRNA和蛋白水平均表达下调，这可能是长时间Cd胁迫引起H₂O₂清除能力下降的结果。

苯丙烷类化合物是通过苯丙烷生物合成途径产生的植物中的一种多酚类化合物，包括酚酸类、黄酮类、木质素类等。苯丙素生物合成途径是植物中最重要的次生代谢途径之一，许多与重金属胁迫相关的苯丙素是植物抗毒素。木质素作为植物细胞壁的主要成分之一，在抵抗重金属胁迫中起着至关重要的作用。当植物遭受重金属胁迫时，细胞壁与重金属离子的螯合是植物成功解毒的关键途径之一。同时，细胞壁结合重金属离子的能力取决于其组分携带的负电荷电量。因此，植物可以通过增加细胞中木质素的含量来提高其结合重金属离子的能力。此外，苯丙素可以作为重金属的螯合剂，用于去除重金属胁迫下产生的活性氧。前期研究表明，铜胁迫增加了水稻木质素的含量；缺陷木质素的水稻突变体lam1和ldm2在根系中表现出较高的Cu积累。所有这些研究表明，木质素的生物合成与重金属胁迫有关。木质素的生物合成受多种不同酶的调控，并与酶活性有关。植物中木质素的含量可以通过调节木质素生物合成途径中的酶活性来改变，也可以利用转基因来控制关键酶的表达。前期研究表明，Prxs参与了木质素的氧化聚合。烟草中ZePrx的过表达可增加细胞壁中的木质素含量；番茄中PpCAD2的过表达可增加茎、叶和果实组织中的木质素含量。本研究中，苯丙素生物合成途径相关的蛋白--SpFAOMT，被注释为木质素生物合成途径的酶，其含量无论是在mRNA水平上还是在蛋白水平上，在Cd胁迫过程中均显著表达上调。对高表达SpFAOMT的东南景天转基因株系的茎进行木质素组织化学染色研究者发现，Cd胁迫后，相较于对照组而言，转基因植株维管中的染色水平明显较深，这表明SpFAOMT参与了木质素的生物合成，SpFAOMT的过表达提高了东南景天木质素的水平。此外，SpFAOMT转基因株系茎叶组织中的Cd含量显著低于东南景天对照株系，这表明SpFAOMT的过表达抑制了Cd向地上组织的转运。研究者认为SpFAOMT的过表达会促进木质素的生物合成途径，并增加木质素的积累，从而抑制Cd向地上组织的转运。

结论

综上所述，在Cd胁迫下对伴矿景天的根系进行了基于TMT标记的蛋白质组定量。使用倍数变化＞1.5以及p＜0.05作为阈值，本研究共鉴别出630个DAPs，主要涉及胁迫、催化以及代谢物的生物合成。为了进一步探究基因和蛋白质的表达模式，研究者对Cd胁迫下伴矿景天根部的转录组和蛋白质组数据进行了整合分析。在共享的基因/蛋白中，共享的209个基因/蛋白无论是在mRNA水平上还是在蛋白水平上均表现出相同的上调或下调趋势，其中涉及一些物质和能量代谢途径，如苯丙素类化合物的生物合成、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢等在mRNA和蛋白水平上均显著富集，并被认为是Cd胁迫过程中的关键途径。对过表达所选基因SpFAOMT的转基因株系进行木质素染色和Cd积累试验，揭示了其在Cd胁迫下木质素生物合成途径中的作用。本研究鉴定出的基因和蛋白质为探究调节Cd胁迫的分子机制提供了新的见解。
原文链接：  https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651321012616

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