科研 |上海农科院 & 青岛农业：通过比较蛋白质组学分析不同二氧化碳浓度下平菇的响应（国人佳作）

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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

平菇（Pleurotus ostreatus）营养价值丰富，价格低廉，生长周期短，是东亚市场常见的食用菌。然而，目前对不同二氧化碳浓度下平菇响应的研究有限。基于此，我们采用无标签LC-MS/MS定量蛋白质组学分析技术，获取不同二氧化碳浓度下采集的平菇子实体菌盖蛋白表达谱，并进行Pearson相关系数分析和主成分分析以揭示样本之间的相关性。我们对差异表达的蛋白质（DEPs）进行注释及分类，同时进行基因本体分析以将DEPs划分为不同的代谢过程和途径。结果表明，与低二氧化碳处理组相比，高二氧化碳处理组的平菇菌柄延伸受到抑制。与正常大气条件下生长的平菇相比，用1%二氧化碳浓度处理的P. ostreatus PH11（平菇的一个品种）中有415个DEPs（其中131个上调和284个下调）。与水解酶活性相关的蛋白质，包括几种酰胺水解酶和细胞壁合成蛋白，在高二氧化碳浓度下高度表达。大多数激酶和延伸因子在高二氧化碳浓度下显著下调。结果提示，在高二氧化碳浓度下，代谢调节和发育过程受到抑制。此外，有性分化过程蛋白Isp4在高二氧化碳浓度下受到抑制，表明有性生殖过程在高二氧化碳浓度下也受到抑制，这与高二氧化碳浓度下小的子实体菌盖不一致。由此得出结论，本实验分析了不同二氧化碳浓度下商业相关食用菌P. ostreatus的蛋白质组。研究结果加深了我们对二氧化碳诱导平菇子实体形态变化机制的认识，这将有助于食用菌的人工栽培。

论文ID

原名：Responses of the Mushroom Pleurotus ostreatus under Different CO2 Concentration by Comparative Proteomic Analyses译名：通过比较蛋白质组学分析不同二氧化碳浓度下平菇的响应
期刊：Journal of FungiIF：5.724发表时间：2022.06通讯作者：于海龙 & 于浩通讯作者单位：上海农业科学院食用菌研究所 & 青岛农业大学生命科学学院

实验设计

实验结果

1. 不同二氧化碳浓度下平菇表型的研究
为了研究二氧化碳变化对P. ostreatus PH11发育的影响，我们将P. ostreatus PH11的菌蕾子实体保持在低浓度（大气条件）或高浓度（1%）的二氧化碳下培养。我们在低二氧化碳和高二氧化碳条件下均观察到子实体发育（图1A - D）；然而，与正常大气条件（LCO）组相比，1%二氧化碳浓度（HCO）组的菌柄长度更短（3.9厘米、9.5厘米）和更薄（图1 B，E）。我们在LCO组中观察到48小时菌盖显著、快速的扩张，而HCO组菌盖生长受到显著抑制，没有担子孢子脱落（图1 C，F）。与高二氧化碳条件相比，我们在低二氧化碳条件下观察到菌盖直径存在差异，表明由于二氧化碳条件的变化，菌盖的功能发生了显著变化。图1 不同二氧化碳浓度下平菇PH11子实体的形态比较（A-C）：在大气条件下培养的平菇子实体（LCO）。（D-F）：在1%二氧化碳浓度（HCO）下培养的平菇子实体。（B,E）在低（B）或高（E）二氧化碳浓度下的平菇菌柄长度，以及（C,F）在低（C）或高（F）二氧化碳浓度下的平菇菌盖直径。
2. 不同二氧化碳条件下平菇的蛋白质组学分析
HCO组中有56种独特的蛋白质，LCO组中有140种独特的蛋白质。根据维恩图（图2D），我们发现在两种不同的二氧化碳处理中有1137种共享蛋白质。主成分分析表明，LCO组（绿色）的四个重复比HCO组（红色）更紧密地聚集在一起。与LCO组相比，HCO处理组显示出更加不同的表达水平。第二主成分在HCO中变化很大，尤其是HCO-4和HCO-1。Pearson相关性表明，不同处理之间的相关性很高，相关系数最低，为0.93（在HCO -4和LCO -3之间），即使在不同的二氧化碳浓度下也是如此（图2 A，C，表S1）。LCO组和HCO组的蛋白质表达谱彼此之间显示出更高的相关性（> 0.93）。此外，主成分分析显示了类似的结果（图2B）。Pearson相关系数分析和主成分分析结果表明，两组样本均合理，生物重复之间相关性良好。图2 两组样本的蛋白质组数据集的PCC分析和PC分析表示（A）蛋白质组数据配对比较的Pearson相关系数分析。（B）来自两组样本的蛋白质组数据的主成分分析。HCO组和LCO组分别位于不同的位置。（C）蛋白质组数据配对比较的热图。（D）两组样本的维恩图
与正常条件下的平菇相比，1%二氧化碳浓度处理的平菇有131个差异表达蛋白（图3和4）。在131个DEPs中，48个是未表征的蛋白质，需要对其进行注释。各种各样的DEPs都被注释了不同的生物学功能。例如，一些DEPs是水解酶（如A0A067NG45和A0A067NTT4），它们催化化学键的水解。核糖体蛋白，如A0A067NG60和A0A067N2P4，在核糖体的形成和功能中发挥作用。几丁质酶，包括A0A067N5C9和A0A067NX05，在蘑菇的菌柄细胞壁延伸中起重要作用。一些DEPs是组蛋白（包括A0A067NL48和A0A067P7W0），它们为染色体提供结构支持。图3 HCO组与LCO组在P. ostreatus PH11中131种高表达蛋白的热图
图4 HCO组与LCO组在平菇中差异表达蛋白的火山图红点表示LCO组中上调的蛋白质。蓝点表示HCO组中上调的蛋白质。灰点表示没有显著差异表达的蛋白质。差异表达蛋白质的阈值是倍数变化超过1.5倍且FDR < 0.05
3. DEPs基因本体富集分析
我们对分子功能（MF）、细胞成分（CC）和生物过程（BP）三类DEPs进行GO分析：通过基因本体分析对标注的DEPs进行分类。这些描述的DEGs分为三个主要的GO类别，CC、MF和BP。结果共有131个DEPs，可分为22个术语，涉及4个BP、6个CC和12个MF术语。每一类中比较显著的术语如下：BP的碳水化合物代谢过程（17）、有机物代谢过程（39）、肽代谢过程（8）和其他代谢过程（40）；CC的无膜细胞器（13）、细胞内非膜结合细胞器（13）、核糖体（7）、细胞内解剖结构（23）、细胞内细胞器（20）和细胞器（20）；和MF的水解酶活性（46）、外肽酶活性（7）、作用于水解O-糖基化合物的水解酶活性（14），作用于糖基键的水解酶活性（14）、催化活性（76）、肽酶活性（14）、作用于碳-氮（但不是肽）键的水解酶活性（6）、丝氨酸水解酶活性（5）、丝氨酸型肽酶活性（5）、金属肽酶活性（5）、核糖体的结构成分（6）和黄素-腺嘌呤-二核苷酸结合（6）（图5，表S2）。这些DEPs可能与1%的二氧化碳浓度有关。碳水化合物、有机物、肽和其他代谢过程在1%二氧化碳浓度组（HCO）中活跃，这表明细胞代谢过程在高二氧化碳浓度条件下是活跃的。从分子功能方面看，水解酶活性、催化活性、肽酶活性、核糖体的结构成分以及黄素-腺嘌呤-二核苷酸结合也证实了平菇中的物质转化和代谢频繁。图5 与LCO组相比，HCO组中P. ostreatus PH11中131个高表达蛋白富集的GO术语气泡大小表示蛋白质计数。气泡颜色表示p值。BP代表生物过程，CC代表细胞成分，MF代表分子功能
4. DEPs的加权基因共表达网络分析
通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），我们总共将1333种蛋白质分为7个不同的模块（最大的蓝绿色的模块中有602种蛋白质，蓝色有374种，黄色有97种，棕色有97种，灰色68种，绿色55种，红色40种）。每个处理组中每个模块的特征基因在对应模块中显示出不同的基因表达水平。与LCO组相比，MEblue模块中的蛋白质在HCO中的表达水平相对较高，而与HCO组相比，MEturquoise模块中的蛋白质在LCO中的表达水平相对较高（图6和7，表S3）。图6 8个样本的样本分布规律
eigengene adjacency热图显示MEred和MEgreen与MEturquoise和MEyellow聚类。MEblue与MEbrown聚集在一起。六个模块中有20个关键基因，其中43个蛋白质是未表征的蛋白质（蓝色、棕色、绿色、红色、蓝绿色、黄色）。许多模块在基因功能上表现出或多或少的交叉，尤其是在MEbrown和MEblue之间。核糖体蛋白在MEbrown、MEblue和MEyellow模块中共享。碱性磷酸酶在MEbrown和MEblue模块中共享。自噬相关蛋白在MEblue和MEred模块中共享。细胞外金属蛋白酶在MEblue和MEbrown模块中共享。糖苷水解酶在MEgreen、MEbrown和MEred模块中共享。糖基转移酶在MEgreen和MEturquoise模块中共享（图8和9，表S4和S5）。图7 加权基因共表达网络分析的softpower。最终选择了九个作为WGCNA分析的power。
图8 加权基因共表达网络分析的模块相关图Eigengene是特定模块的第一个主成分基因，代表模块的整体基因表达水平。
在MEblue模块中，关键基因具有细胞外金属蛋白酶、碱性磷酸酶、脂肪酶_3结构域蛋白、核糖体蛋白、自噬相关蛋白、水解酶1结构域蛋白、几丁质酶、纤维素酶、Oxidored_FMN结构域蛋白等功能，与LCO组相比，这些基因与HCO组高表达有关。在MEbrown模块中，关键基因作为核糖体蛋白、糖苷水解酶、微管蛋白、碱性磷酸酶、细胞外金属蛋白酶和含有RNA结合结构域的蛋白等发挥作用。在MEgreen模块中，关键基因的功能是糖苷水解酶、糖基转移酶、NADH-细胞色素b5还原酶、核糖核酸酶、含Iso_dh结构域的蛋白质、二肽基-肽酶、氨甲基转移酶、含AMP结合结构域的蛋白质、丙酮酸激酶、酪氨酸-tRNA连接酶、几丁质合酶、CN水解酶、NAD（P）-bd_dom结构域蛋白、FMN羟基酸脱氢酶等。图9 加权基因共表达网络分析的模块相关图基因通过基因之间的相异性进行聚类，将基因树划分为不同的模块。

讨论

二氧化碳是细胞呼吸的最终产物。二氧化碳是所有生物体中的关键细胞信号分子。在生命的大多数基本方面，二氧化碳通过膜的传输对于生命维持具有重要作用。不依赖于pH和O₂的细胞可以通过特定的信号通路感知高浓度的二氧化碳，从而产生不同的影响（表型）。二氧化碳引起的植物生长增强表明，大气中二氧化碳的上升促成了过去200年的灌木丛扩张。二氧化碳在哺乳动物的呼吸作用、植物和藻类的微生物光合作用以及昆虫的化学感受中起着关键作用。在有性生殖过程中，二氧化碳抑制细胞间融合，但不抑制丝状化。升高的二氧化碳直接或间接影响植物与生物的相互作用。例如，升高的二氧化碳会改变活性氧信号传导、植物激素次级代谢和防御相关发育。升高的二氧化碳也直接或间接影响害虫和病原体种群中的食草或发病机制相关性状，并通过干扰害虫的化学通讯和间接防御来改变捕食者与猎物的相互作用。在之前的一项研究中，二氧化碳被证明会影响蘑菇的子实体发育，例如裂褶菌、金针菇和双孢蘑菇。然而，目前对不同二氧化碳浓度下平菇的响应研究还很有限。高二氧化碳水平对菌盖延伸的抑制在平菇中尤为显著，导致菌盖呈喇叭状变形，菌柄偶尔肿胀并伴有海绵状组织，偶尔还会出现畸形的小菌盖表面。在高二氧化碳浓度下，菌盖（担子孢子形成区域）的延伸受到抑制。有人已经在粟酒裂殖酵母和其他一些真菌中研究了性分化过程蛋白，并且已发现isp4被氮饥饿诱导的减数分裂上调。A0A067N4P4可能参与平菇的减数分裂和繁殖，与粟酒裂殖酵母中的Isp4具有53.0%的氨基酸序列同一性（NP_595653）。高二氧化碳浓度下未成熟的菌盖也会抑制有性生殖过程。在自然环境中，二氧化碳浓度越高，通风越差，不利于担子孢子的扩散。因此，蘑菇可能通过控制子实体形态来控制性过程。GO富集表明与水解酶活性相关的酶[GO:0016810]在高二氧化碳浓度下显著富集（具有最低p值）。部分氨基水解酶在HCO组显著高表达，而在LCO组没有显著下调。Alfonso等人报道酰胺水解酶可能与青霉素的自溶有关，Donovan等人报道酰胺水解酶可能与细胞壁溶解有关。因此，HCO组中酰胺水解酶的高表达表明细胞壁生物合成可能受到高二氧化碳浓度的影响。事实上，一些细胞壁合成相关蛋白在高二氧化碳浓度（A0A067NEG7）下也显著高表达，例如壳寡糖氧化酶（A0A067NL12）、几丁质脱乙酰酶和几丁质酶3样蛋白2（A0A067NHR3）。结果表明，高二氧化碳浓度下平菇的形态变化受细胞壁生物合成的差异表达调控。激酶介导的蛋白质磷酸化在细胞过程的调节中起关键作用。生理浓度下的二氧化碳可通过直接刺激环化酶活性来诱导菌丝形成。丝状化是由第二信使介导的，如腺苷酸环化酶合成的环腺苷30,50-单磷酸（cAMP）。在真菌中，cAMP信号通路和二氧化碳传感之间的联系是保守的，cAMP信号通路反过来控制真菌的生长、分化和毒力因子。不同的激酶可能参与随后的细胞过程调节。在高二氧化碳浓度下，许多激酶的表达显著下调，如A0A067NLY8、A0A067NNC2、A0A067NJ97、A0A067NHQ7、A0A067N5R0、A0A067NR52、A0A067NIN8、A0A067PB97、A0A067N9N0、A0A067NAM8和A0A067NE46。然而，我们没有发现激酶在高二氧化碳浓度下高表达。在本研究中，蛋白质组学分析的样本是菌盖部分。小菌盖结合蛋白质组学分析结果表明，高二氧化碳条件下代谢活性较低。高二氧化碳浓度可能会抑制激酶的表达，从而进一步抑制子实体菌盖的代谢和发育。我们通过蛋白质组学分析确定了7个延伸因子（表S1）：五种延伸因子的表达在高二氧化碳浓度下显著下调，一种延伸因子的表达在高二氧化碳浓度下不显著下调，一种仅在低二氧化碳浓度下表达。翻译延伸因子复合物在蛋白质合成中起着核心作用，将氨酰-tRNAs传递给延伸的核糖体，延伸因子的表达在真核生物中是必不可少的。在高二氧化碳浓度下，延伸因子的下调可能会抑制蛋白质合成，这与激酶的下调不一致。因此，延伸因子可能与二氧化碳介导的平菇形态变化有关。

结论

本研究调查了不同二氧化碳浓度下商业相关食用真菌平菇的蛋白质组分析。与LCO组相比，HCO组的菌柄更短更薄。与HCO组相比，LCO组的菌盖直径更大。本研究介绍并讨论了在较高和较低二氧化碳浓度下差异表达的蛋白质。根据我们的结果，激酶和延伸因子的表达在不同的二氧化碳浓度下受到调节，因此与细胞壁合成和有性分化过程相关的蛋白质的表达发生了显著变化。这些过程中的蛋白质可以作为选择性分子育种的靶点。其他蛋白，如cAMP信号处理或碳酸氢盐代谢相关蛋白在平菇二氧化碳响应中的作用仍需进一步研究。
原文链接：  https://www.mdpi.com/2309-608X/8/7/652

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