科研 |温州大学生&浙江农科院：蛋白质组学揭示了鸡腿菇采后子实体自溶的机制（国人佳作）
编译：微科盟-刘俊杰，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
导读食用蘑菇的子实体在采收后会发生自溶（autolysis）现象，主要表现在组织变软发褐，菌盖张开呈伞状，子实体液化为墨状液滴，因此蘑菇保质期通常比蔬果短，为采后保鲜储存带来挑战。鸡腿菇（Coprinus comatus）味美，有抗氧化、抗癌、保肝和降血糖等功效，但室温放置3天后会快速自溶。已有研究表明在蘑菇变质的过程中，其化学成分和酶活发生变化，尤其是几丁质酶和糖苷酶。然而鸡腿菇采后自溶机制仍不清楚。基于串联质谱标签（Tandem Mass Tag，TMT）的定量蛋白质组学被广泛应用于测定蘑菇和蔬果等收获后的蛋白丰度。本研究采用定量蛋白质组学和生物信息学分析揭示了鸡腿菇采后复杂的自溶机制：菌盖张开前，核糖体可能调节了自溶过程中的细胞壁水解和能量合成等碳水化合物代谢；GO和KEGG分析表明，菌盖张开后，活性氧的积累和丝裂原活化蛋白激酶的激活与自溶相关。通过测定细胞壁组分和水解酶活性在自溶过程中的变化验证了以上分析结果。该研究为采后生理学研究和蘑菇自溶机制的揭示提供新的视角，也为制定鸡腿菇采后保鲜策略提供理论基础。
论文ID
原名： Proteomics Reveals the Mechanism Underlying the Autolysis of Postharvest Coprinus comatus Fruiting Bodies译名：蛋白质组学揭示了鸡腿菇采后子实体自溶的机制期刊：Journal of Agricultural and Food ChemistryIF：5.279发表时间：2022.02通讯作者：曲航 & 郜海燕
通讯作者单位：温州大学生命与环境科学学院，浙江省农业科学院食品科学研究所
实验设计
实验结果
1. 鉴定差异丰度蛋白（Differentially Abundant Proteins，DAPs）
使用串联质谱标签（TandemMass Tag，TMT）法鉴定蛋白后，获得了不同样品的DAPs（差异标准：FC> 1.2或< 0.83，p < 0.05）。O/B组与E/O组分别鉴定出205和161个DAPs，其中有88个DAPs均在O/B组和E/O组。
在88个DAPs中，22个DAPs在两组均上调，11个DAPs在两组均下调，37个DAPs在O/B组上调但在E/O组下调，18 个DAPs在O/B组下调但在E/O组上调（图1）。从蛋白表达模式的角度来看，鸡腿菇菌盖在张开前后的自溶机制是有区别的。
图1. 在O/B组和E/O组中均出现的DAPs的聚类热图
所有样品均有3个重复处理组，分别是B1–3，O1–3和E1–3。
先前的研究表明蘑菇自溶与菌盖张开有关，但并没有细致研究过蘑菇自溶过程中的生理和代谢变化。基于UniprotKB数据库发现DAPs主要是核糖体蛋白和参与碳水化合物代谢的蛋白。E/O组的大多数的核糖体蛋白表达没有显著变化，但O/B组的核糖体蛋白丰度显著降低（表1），表明核糖体蛋白在鸡腿菇菌盖张开前可能发挥重要作用。
先前研究表明细胞壁高度降解与蘑菇的变质有关。本研究发现水解细胞壁多糖和破坏细胞壁结构的蛋白有差异表达（表2）。大多数水解酶从自溶早期到菌盖张开期间的表达上调，表达量在菌盖张开时达到顶峰，而在自溶后期迅速下降。几丁质酶在O/B组上调（FC=6.17，p < 0.05），在E/O组无明显差异变化。因此推测核糖体蛋白通过上调细胞壁代谢酶来参与菌盖张开前的自溶过程。
表1. O/B 组和E/O 组的DAPs
鸡腿菇采后取样时期为存储初期（the beginning of storage ，B），菌盖张开期（pileus opening，O）和自溶结束期（the end of autolysis，E）。
表2. O/B和E/O组中与细胞壁代谢相关的DAPs
鸡腿菇采后取样时期为存储初期（the beginning of storage ，B），菌盖张开期（pileus opening，O）和自溶结束期（the end of autolysis，E）。
一些与碳水化合物代谢相关的DAPs主要参与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）和磷酸戊糖（pentose phosphate）途径，并且在O/B和E/O组中都显著上调（表3）。
有研究表明与TCA循环相关的蛋白上调后可以增加ATP和提供充足能量用于维持蘑菇采后基础生理代谢，充足的ATP供应能维持蔬果采后膜完整性和降低氧化胁迫。鸡腿菇采后的能量供应主要来源于糖，蛋白质和脂类的分解，因此关注以上与碳水化合物代谢相关的DAPs有助于理解鸡腿菇采后自溶的机制。
表3. O/B和E/O组中有关能量生物合成的DAPs
鸡腿菇采后取样时期为存储初期（the beginning of storage ，B），菌盖张开期（pileus opening，O）和自溶结束期（the end of autolysis，E）。
2. DAPs亚细胞定位
蛋白在细胞内的定位与其功能密切相关，例如与其他生物分子相互作用。O/B组和E/O组的DAPs亚细胞定位没有显著区别，都集中分布在细胞质，线粒体，细胞核和胞外基质（图2A和D）。
无论是O/B组还是E/O组，其上调和下调DAPs的亚细胞定位都差不多：O/B组上调DAPs主要分布在细胞质，胞外基质和线粒体（图2B），下调DAPs主要分布在细胞质，线粒体和细胞核（图2C）；E/O组上调DAPs主要在细胞质，线粒体和细胞核，下调DAPs主要分布在细胞质，线粒体和胞外基质（图2F）。
同时，自溶早期的胞外蛋白的表达量显著上调，而在自溶晚期下调。细胞核蛋白的表达模式则与胞外蛋白相反。
图2. 基于亚细胞定位对DAPs的分类
饼图A，B，C分别展示了O/B组，O/B组上调和O/B组下调的蛋白的亚细胞定位情况。饼图D，E，F分别展示了E/O组，E/O组上调和E/O组下调的蛋白的亚细胞定位情况。
胞外蛋白激酶，消化酶和水解酶广泛参与众多生物学过程，胞外酶与胞外信号传导途径有关。本研究发现胞外蛋白和细胞壁代谢酶的变化趋势一致，表明上调胞外蛋白可能通过增强葡糖苷酶（glucosidase）和几丁质酶表达导致菌盖张开前的自溶现象的发生。
有研究表明细胞转运至核内后，主要负责调节与细胞代谢和生长等相关基因的表达。在菌盖张开前，下调核蛋白的表达可以影响核糖体蛋白的表达，而在菌盖张开后，上调核蛋白可能调节响应刺激的基因的表达。
3. DAPs的GO分析
利用GO分类和GO富集（p <0.05）预测鸡腿菇子实体采后自溶相关蛋白的功能（图3）。O/B组有24个BP项，8个MF项目和16个CC项（图3A）；E/O组有9个BP项和4个MF项（图3B）。
O/B组的BP项主要是“蛋白代谢过程”，“多肽代谢过程”，“翻译”和“大分子生物合成过程”；E/O组的BP项主要是“碳水化合物衍生物的生物合成过程”。
O/B组的主要MF项是“核糖体的结构组成”和“结构分子活性”；E/O组的主要MF项是“裂解酶活性”，包括3-isopropylmalate dehydratase，顺乌头酸水合酶（aconitatehydratase）和二羟基酸脱水酶（dihydroxy-acid dehydratase）等参与TCA循环的代谢酶。
O/B组的CC项主要是“胞质成分”，“含蛋白复合体”和“核糖体”；E/O组并无显著富集的CC项。
以上分析表明菌盖张开前后的自溶机制有差别，并且核糖体蛋白调控是早期自溶的主要原因，TCA循环的增强可能是后期自溶的诱因。
图3. 鸡腿菇DAPs在O/B组（A）和E/O组（B）中的GO富集项。
4. KEGG通路分析
自溶早期有103个富集的KEGG途径，其中62个上调，41个下调，部分显著变化的通路已展示在图4A。只有“核糖体”通路的富集具有显著性（p < 0.05），表明核糖体通路主要负责菌盖张开前的变质和自溶，作用机理可能是影响与碳水化合物代谢相关蛋白的合成。
在自溶晚期，78个KEGG通路上调，22个KEGG通路下调，图4B展示了部分通路。先前研究表明丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase）信号传导途径对香菇子实体和菌褶（gills）的发育有重要影响。然而当前还未有关于MAPK信号传导途径参与鸡腿菇自溶的报道，因此研究者推测MAPK信号传导途径可能响应采后变质。
图4. O/B组（A）和E/O组（B）的部分典型的上下调DAPs的KEGG通路富集条形图。
5. 蛋白互作
蛋白之间通过形成复合体或高度聚集可以发挥许多生物学功能，有研究表明蛋白之间紧密连接后对代谢或信号转导途径有关键作用。本研究的蛋白互作网络已总结于图5，具体数据在附表1。
O/B组共46个DAPs的连接度（connection degree）>1，其中25个属于核糖体蛋白的DAPs聚集在一起（图5A），该结果与KEGG通路富集一致，证明了核糖体蛋白在菌盖张开前的自溶过程中主要作用。核糖体由rRNA和核糖体蛋白组成，是翻译过程中的关键大分子聚合物，因此核糖体蛋白的丰度降低会抑制整体的蛋白合成能力。核糖体蛋白与核苷二磷酸激酶（K5W801），丝氨酸羟甲基转移酶 （K5WYB4）和其他一些未鉴定蛋白（K5VP36, K5WXE7）等有较高的连接度，表明自溶早期的核糖体对碳水化合物代谢有调节功能。
然而并研究者未观察到几丁质酶（A0A137QYL1），葡糖苷酶（A0A137QT12，A0A137QKG3），半乳糖苷酶（galactosidase）（K5WW10，A0A137Q843）和甘露糖苷酶（mannosidase）（A0A137QWU5，A0A137Q8U3）等与细胞壁代谢相关且上调的酶与核糖体蛋白之间存在明显结合作用，因此推测核糖体蛋白的差异表达间接介导了水解酶的表达改变，该现象与前人报道一致。
图5. O/B组（A）和E/O组（B）的DAPs蛋白互作网络。
圈的颜色表明蛋白丰度，大小表示蛋白连接度。粉色代表蛋白上调，紫色代表蛋白下调。
E/O组有39个DAPs的连接度>1，核糖体蛋白的数目和连接度都显著减少（图5B），并且只有少数与碳水化合物代谢酶相关的蛋白，该现象与葡糖苷酶和半乳糖苷酶在菌盖张开后下调一致。
与TCA循环和ATP产生相关的蛋白之间的连接度较高，包括ATP柠檬酸合酶（K5X1D8),ATP依赖的6-磷酸果糖激酶（K5X6Y6），核苷二磷酸激酶（K5W801），磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ATP)（K5W1X6），异柠檬酸脱氢酶[NADP]（K5X5H4）和乙酰辅酶A合成酶（K5WS49)（图5B）。这些蛋白表达均上调，并且已被验证参与了代谢能量生成，提供ATP和维持呼吸及其他基础生理活动等过程。因此，鸡腿菇存储后期的主要生物学过程主要是能量的生物合成。
有研究表明ATP主要源自TCA循环，该反应产生的NADH等含氢化合物在呼吸电子传递链中释放能量并伴随大量活性氧产生。通常状态下，细胞内的自由基和活性氧的生成与清除是动态平衡的。当蘑菇采后存储时间过长时，自由基和活性氧会大量积累并破坏平衡状态。因此包括硫氧还蛋白还原酶（K5XVG2）和二氢硫辛酸脱氢酶（K5X8L3）等在内的氧化还原酶与参与存储后期的TCA循环和ATP产生有关。硫氧还蛋白还原酶直接作用于延胡索酸还原酶(K5WZ26）后，可以逆转从延胡索酸盐到琥珀酸盐的还原反应。蛋白互作分析表明二氢硫辛酸脱氢酶与ATP-柠檬酸合酶和ATP-依赖的6-磷酸果糖激酶等蛋白的连接度较高。
先前研究表明在动植物和微生物等许多真核生物中，氧化胁迫能激活MAPK级联途径。KEGG通路分析表明MAPK信号传导途径在鸡腿菇菌盖张开后的自溶过程中发挥了关键作用。然而，还需要更多研究来探究采后鸡腿菇子实体自溶的MAPK途径是否受活性氧激活。
6. 验证蛋白质组学分析
以上TMT蛋白质组学分析表明鸡腿菇子实体采后自溶机制十分复杂。核糖体可能参与调节碳水化合物代谢酶的表达，例如细胞壁代谢酶上调导致细胞壁多糖降解和细胞壁结构收到破坏，以此触发早期自溶机制。呼吸作用和代谢产生的自由基（free radical）和活性氧积累是蘑菇变质的原因，因此MAPK级联（MAPK cascades）途径或许是后期自溶的主要原因。研究者通过以下实验确认了以上所得的蛋白组数据的有效性。
蘑菇的细胞壁与蔬果不同，主要是由葡聚糖（glucans），几丁质（chitin）和碳水化合物多聚体（carbohydrate polymers）交织而成的。存储初期的纤维素酶（cellulase），几丁质酶和葡聚糖酶（glucanase）的活性显著升高（p < 0.05），进而增加了纤维素（cellulose）和几丁质的含量，降低了葡聚糖的含量（图6A-C）。菌盖张开后，酶活迅速下降（图6D-F），与蛋白组数据一致。纤维素，几丁质和葡聚糖含量的持续降低（p < 0.05）为能量合成提供了底物，意味着细胞壁结构将进一步被破坏。
超氧阴离子（O2·–），过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）的水平在整个存储期间持续增加，在自溶结束时达到最高水平（图7A-C），导致超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）等氧化还原酶的活性剧烈增加（图7D-F）。以上结果与TMT蛋白组分析结果和相关文献报道一致。
图6. 鸡腿菇子实体在采后的细胞壁组分纤维素（A），几丁质（B）和葡聚糖（C）的含量变化和细胞壁代谢酶纤维素酶（D），几丁质酶（E）和葡聚糖酶（F）的活性变化。a，b，c分别代表在p< 0.05水平上的不同组间显著性差异。
图7. 鸡腿菇子实体在采后的超氧阴离子（O2·–）产生量（A），过氧化氢（H2O2）含量（B）和丙二醛（MDA）含量（C）的变化和超氧化物歧化酶（SOD）（D），过氧化氢酶（CAT）（E）和过氧化物酶（POD）（F）的活性变化。a，b，c分别代表在p< 0.05水平上的不同组间显著性差异。
生信分析表明，存储后期的MAPK信号传导途径是参与自溶过程的主要机制。有研究报道真菌共有的two-component phosphorelay system能激活MAPK信号传导途径。正常条件下，包括Sln1和Chk1等membranesensor kinase被激活后转运到响应调节器。phosphorylated responsekinase会抑制MAPKK kinase（MAPKKK）和钝化MAPK kinase（MAPKK）-MAPK信号传导途径。two-component phosphorelay system受到抑制后，激活了MAPK级联反应并将胁迫信号传递给下游的转录因子来响应氧化胁迫等环境压力，例如MAPK级联反应能上调蘑菇子实体的CAT表达。
另一方面，MAPK途径导致细胞周期停滞和细胞融合，加速了细胞和个体自溶。由于真菌的各物种对two-component phosphorelay system的响应不同，因此需要系统全面地阐明MAPK信号传导途径的上下游调节机制，以此解释MAPK信号传导途径如何参与蘑菇采后自溶过程。
总之，鸡腿菇采后存储过程中的自溶机制十分复杂：菌盖张开前，核糖体可能通过上调了碳水化合物代谢酶介导自溶发生；菌盖张开后，活性氧的积累和MAPK信号传导途径的激活或许与自溶有关。未来需要深入研究活性氧在自溶过程中的作用以及鸡腿菇子实体中细致的自溶分子机制。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35076245/
----------微科盟更多推荐----------
科研 |青岛农业：白玉菇发育阶段蛋白质组学的比较分析(国人佳作）
科研 | 华南农业：比较转录组和蛋白质组学研究为白灵菇子实体采后变质的调控机制提供新思路（国人佳作）
如果需要原文pdf，请扫描文末二维码领取
蛋白质组长期接受科研文章/经验投稿，期待与您交流更多蛋白质组学问题
（联系多组学老师即可投稿&申请入群）
请关注下方公众号
了解更多蛋白质组知识
蛋白质组仅用于学术成果分享与交流，不涉及商业利益。
也严禁他人将本公众号的内容用于商业运营。