circRNA-seq：CIRCexplorer2 使用指南（二）

Original JunJunLab 老俊俊的生信笔记 2022-08-15

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1、环状 RNA 融合连接 Reads 的比对

CIRCexplorer2 支持 TopHat2/TopHat-Fusion 和其他比对软件(STAR, segemehl, BWA 和 MapSplice)。虽然不同的比对软件在环状 RNA 鉴定上略有差异，但 TopHat2/TopHat-Fusion 与 Cufflinks 完全匹配。因此，建议在比对步骤中使用 TopHat2/TopHat-Fusion，特别是对于环状 RNA denovo pipeline。

1TopHat2/TopHat-Fusion

由于 TopHat2 需要基因注释文件进行更好的比对，你可以从 hg19_ref.gtf、hg19_kg.gtf 和 hg19_ens.gtf 中选择一个 GTF 文件。另外，TopHat2 需要 bowtie2 的基因组索引文件，TopHat-Fusion 需要 bowtie1 的索引，所以你可以提前索引基因组序列或者让 CIRCexplorer2 比对从头开始：

1、从索引文件开始：

$ CIRCexplorer2 align -G hg19_kg.gtf -i bowtie1_index -j bowtie2_index -f RNA_seq.fastq > CIRCexplorer2_align.log

2、CIRCexplorer2 自动建索引，从基因组序列开始：

$ CIRCexplorer2 align -G hg19_kg.gtf -g hg19.fa -f RNA_seq.fastq > CIRCexplorer2_align.log

注意：

1、由于 Cufflinks 与 TopHat2/TopHat-Fusion 兼容，因此建议使用 TopHat2/TopHat-Fusion 进行比对。
2、CIRCexplorer2 align 将创建一个目录 alignment，以及后续分析所需的 BED 文件 fusion_junction.bed。还可以查看 tophat.log 和 tophat_fusion.log 文件以获取 Tophat2 和 TopHat-Fusion 对齐的详细日志。
3、TopHat 只支持 Python2，所以不建议运行 Python3 版本的 CIRCexplorer2。

2手动比对

TopHat2/TopHat-Fusion：

## 比对获取 unmapped.bam 转fastq
$ tophat2 -a 6 --microexon-search -m 2 -p 10 -G knownGene.gtf -o tophat hg19_bowtie2_index RNA_seq.fastq

## unmapped.bam 转fastq
$ bamToFastq -i tophat/unmapped.bam -fq tophat/unmapped.fastq

## 再次比对
$ tophat2 -o tophat_fusion -p 15 --fusion-search --keep-fasta-order --bowtie1 --no-coverage-search hg19_bowtie1_index tophat/unmapped.fastq

STAR：

$ STAR --chimSegmentMin 10 --runThreadN 10 --genomeDir hg19_STAR_index --readFilesIn RNA_seq.fastq

MapSplice：

$ mapsplice.py -p 10 -k 1 --non-canonical --fusion-non-canonical --min-fusion-distance 200 -c hg19_dir -x bowtie1_index --gene-gtf hg19_kg.gtf -1 RNA_seq.fastq

BWA：

$ bwa mem -T 19 -t 10 hg19_bwa_index RNA_seq.fastq > RNA_seq_bwa.sam

segemehl：

$ segemehl.x -q RNA_seq.fastq -d hg19.fa -i hg19_segemehl.idx -S -M 1 -t 10 -o RNA_seq.sam
$ testrealign.x -d hg19.fa -q RNA_seq.sam -n

注意：

你可以通过其他比对软件来比对来自 TopHat2 比对 (circ_out/tophat/unmapped.fastq) 结果的未必对的 reads。

对于双端测序：

STAR：

$ STAR --chimSegmentMin 10 --runThreadN 10 --genomeDir hg19_STAR_index --readFilesIn read_1.fastq read_2.fastq

TopHat-Fusion：

$ tophat2 -o tophat_fusion -p 15 --fusion-search --keep-fasta-order --bowtie1 --no-coverage-search hg19_bowtie1_index read_1.fastq read_2.fastq

2、环状 RNA 融合 Reads 的解析

CIRCexplorer2 可以单独解析比对结果，这样就可以支持很多 aligner，支持双端数据。

如果已使用 CIRCexplorer2 align 比对，则可以跳过此步骤。

对于不同的比对软件：

## 1、TopHat2/TopHat-Fusion
$ CIRCexplorer2 parse -t TopHat-Fusion tophat_fusion/accepted_hits.bam > CIRCexplorer2_parse.log
## 2、STAR
$ CIRCexplorer2 parse -t STAR Chimeric.out.junction > CIRCexplorer2_parse.log
## 3、MapSplice
$ CIRCexplorer2 parse -t MapSplice mapsplice_out/fusions_raw.txt > CIRCexplorer2_parse.log
## 4、BWA
$ CIRCexplorer2 parse -t BWA RNA_seq_bwa.sam > CIRCexplorer2_parse.log
## 4、segemehl
$ CIRCexplorer2 parse -t segemehl splicesites.bed > CIRCexplorer2_parse.log

注意：

CIRCexplorer2 parse 会默认创建一个文件 back_splied_junction.bed 供后续分析使用。

对于双端测序：

## 1、STAR
$ CIRCexplorer2 parse -t STAR Chimeric.out.junction > CIRCexplorer2_parse.log
## 2、TopHat-Fusion
$ CIRCexplorer2 parse --pe -t TopHat-Fusion tophat_fusion/accepted_hits.bam > CIRCexplorer2_parse.log

3、环状 RNA 的注释

这一步是对 CIRCexplorer 的克隆和整合，使 CIRCexplorer2 继承 CIRCexplorer 的所有功能。

命令：

$ CIRCexplorer2 annotate -r hg19_ref_all.txt -g hg19.fa -b back_spliced_junction.bed -o circularRNA_known.txt > CIRCexplorer2_annotate.log

注意：

1、它将比较 back_spliced_junction.bed 和基因注释文件（hg19_ref_all.txt）来确定环状 RNA 的边界，并进行重新排列以修复一些错误排列。
2、CIRCexplorer2 annotate 将创建一个包含 circRNA 信息的输出文件 circleRNA_known.txt。

4、环状 RNA 转录本的从头组装

CIRCexplorer2 使用 Cufflinks 对环状 RNA 转录本进行从头组装，并根据组装结果表征可变剪接。因此，这是分析环状 RNA 的选择性反向剪接和选择性剪接的之前的关键步骤。

命令：

$ CIRCexplorer2 assemble -r hg19_ref_all.txt -m tophat -o assemble > CIRCexplorer2_assemble.log

注意：

1、它将使用 Cufflinks 将环状 RNA 转录本与 poly(A)-/ribo- RNA-seq 的比对结果（tophat）组装在一起。
2、CIRCexplorer2 assemble 会默认创建一个目录 assemble。所有环状 RNA 转录本的组装信息都将在 assemble 目录下创建。还可以查看 cufflinks.log 文件以获取 cufflinks 组装的详细日志。

5、环状 RNA 选择性剪接的鉴定

CIRCexplorer2 将系统地鉴定两种类型的 反向可变剪接事件 （5' 反向剪接位点和3' 反向剪接位点）和四种类型的可变剪接事件（盒式外显子、内含子保留、5' 可变剪接位点和3' 可变剪接位点）。

命令：

$ CIRCexplorer2 denovo -r hg19_ref_all.txt -g hg19.fa -b back_spliced_junction.bed --abs abs --as as -m tophat -n pAplus_tophat -o denovo > CIRCexplorer2_denovo.log

注意：

1、它需要来自相应 poly(A)−/ribo− RNA-seq 的相同来源的 poly(A)+ RNA-seq 的比对结果（设置为 -n）（设置为 -m），以便提取环状 RNA 在将 poly(A)-/ribo- RNA-seq 与 poly(A)+ RNA-seq 进行比较后，占主导地位的替代（反）剪接事件。
2、CIRCexplorer2 denovo 默认会创建三个目录 denovo，as 和 abs。所有环状 RNA 的可变（反向）剪接信息都将在这些目录下创建。每个可变（反向）拼接事件都有一系列的衡量标准，你可以根据自己的要求筛选相关事件。

6、一句命令运行 CIRCexplorer2

CIRCexplorer2 包含 5 个模块，可为多个环状 RNA 分析任务提供灵活性。但是，它会混淆许多对 CIRCexplorer2 不太熟悉的人，并阻止人们很好地使用它。于是，我们编写了 fast_circ.py 脚本来集成不同的模块组合来完成不同的任务。

用法：

$ fast_circ.py parse -r REF -g GENOME -t ALIGNER [--pe] [-o OUT] <fusion>
$ fast_circ.py annotate -r REF -g GENOME -G GTF [-p THREAD] [-o OUT] -f FQ
$ fast_circ.py denovo -r REF -g GENOME -G GTF [-n PLUS_OUT] [-p THREAD] [-o OUT] -f FQ

参数说明：

-h --help Show help message. # 帮助文档
-r REF --ref=REF Gene annotation. # 注释文件
-g GENOME --genome=GENOME Genome FASTA file. # 基因组文件
-G GTF --gtf=GTF Annotation GTF file. # GTF 文件
-t ALIGNER Aligner (TopHat-Fusion, STAR, MapSplice, BWA, segemehl). # 比对软件
--pe Parse paired-end alignment file (only for TopHat-Fusion). # 指定为双端测序数据
-f FQ --fastq=FQ Input file. # 输入 fastq 文件
-n PLUS_OUT --pAplus=PLUS_OUT TopHat mapping directory for p(A)+ RNA-seq. # p(A)+ RNA-seq 结果文件目录
-p THREAD --thread=THREAD Running threads. [default: 10] # 线程数
-o OUT --output=OUT Output directory. [default: .] # 输出目录

怎么使用？

Annotating pipeline：

如果你使用列出的比对软件之一（TopHat2/TopHat-Fusion、STAR、segemehl 和 MapSplice）比对 RNA-seq reads，你应该使用 fast_circ.py parse 与基因注释文件（通过 -r) 和参考基因组序列文件（通过 -g）。同时，还应该指出它的比对软件（通过 -t）以及读取是否为双端（通过 --pe）。
如果你只有 原始 RNA-seq reads ，则可以使用 fast_circ.py annotate 将 RNA-seq reads 与 TopHat2/TopHat-Fusion 比对。你应该提供基因注释文件（通过 -r）、基因注释 GTF 文件（通过 -G）、参考基因组序列文件（通过 -g）和原始读取 fastq 文件（通过 -f）。

Characterization pipeline：

fast_circ.py denovo 将原始 RNA-seq reads 与 TopHat2/TopHat-Fusion 比对，并从头组装环状 RNA 转录本，最后提取可变（反向）剪接事件。一些选项与 fast_circ.py 注释相同。
如果提供 p(A)+ RNA-seq（通过 -n）的 TopHat 比对目录，fast_circ.py denovo 将获取所有可变剪接事件。否则，它只获取可变的反向剪接事件。

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