eRNA 上的 m6A 修饰可以促进转录凝聚物的形成和基因激活

Original JunJunLab 老俊俊的生信笔记 2022-08-15

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1、介绍

今天分享一篇今年 8 月份发表在 cell 上的一篇文章：

通讯作者介绍：

背景介绍：

“
”

2、摘要

“
对转录控制中新生 RNA 的机制理解仍然有限。在这里，由高灵敏度方法甲基化刻录的新生转录本测序（MINT-seq），我们表征了 N6-甲基腺苷 (m6A) 在新生 RNA 上的景观。我们发现了大量但选择性的 m6A 沉积在转录调控元件产生的新生 RNA 上，包括启动子上游反义 RNA 和增强子 RNA (eRNA)，与它们的长度、和 RNA 丰度，包含 m6A 基序呈正相关。m6A-eRNA 标记高度活跃的增强子，在那里它们招募核 m6A 阅读器 YTHDC1 ，本质上取决于其 C 末端的方式相分离成液体状凝聚物无序区域和精氨酸残基。m6A-eRNA/YTHDC1 凝聚物共同混合并促进 BRD4 共激活因子凝聚物的形成。因此，YTHDC1 耗竭减少了 BRD4 凝聚物及其向增强子的募集，导致增强子和基因激活受到抑制。我们提出 eRNA 的化学修饰与阅读器蛋白在增强子激活和基因转录调控发挥了广泛的作用。
”

3、结果

1、m6A 普遍但有选择性的在 eRNA 上沉积

作者结合 TT-seq 和 MeRIP-seq 开发了 MINT-seq，鉴定更多的 eRNA 上的 m6A 修饰相比于传统的 MeRIP-seq 而言：

观察到含有 m6A 修饰的 eRNA 上游也有增强子的活性标记，如 p300，BRD4，H3K27ac 等，使用 MMR 值来表征新生 RNA 上的 m6A 的相对水平，此外不同细胞系之间的 eRNA 表现很强的细胞特异性。含有 m6A 修饰的 eRNA 和 uaRNA 的 m6A 的相对水平更高一些：

eRNA 上的 m6A 基序在转录本中间更多一些，uaRNA 则是逐渐减少。eRNA 的转录长度较长 > 10kb。含有 m6A 修饰的 eRNA 的转录长度更长，m6A 基序跟多，相对稳定性更高（TT-seq RPKM、RNA-seq RPKM 及 RNA-seq/TT-seq 的比值）：

在不同细胞系和其它文章的数据都表现类似的结果：

2、m6A 对于 eRNA 的长度、稳定性的积极作用

eRNA 上的 m6A 水平与 E2（雌二醇：可诱导细胞产生 eRNA）诱导等外界条件刺激无关，与其本身的序列有关，RT-qPCR 和 MeRIP-qPCR 验证了这个结果：

为了研究 METTL3 和 METTL14 对 eRNA 上的 m6A 的影响，作者做了双敲实验，在双敲的细胞系中，MeRIP-seq、RT-qPCR 和 MeRIP-qPCR 实验表明，eRNA 的转录水平和 m6A 水平都显著下降了。使用 METTL3 的小分子抑制剂 UZH1A 抑制 METTL3 后，结果类似：

为了排除 m6Am 的影响，敲低了 m6Am 的甲基转移酶 PCIF1，发现 eRNA 的转录水平没有受到影响：

3、m6A-eRNA 招募 YTHDC1 来刺激增强子和基因转录激活

eRNA 上的 m6A 和其活性因子有较高的相关性，热图显示增强子 eTSS（eRNA 的转录起始位点）处也富集了这些因子的结合。BRD4 对于有 m6A 修饰的 eRNA，对于 eTSS 的结合能力更强。

使用 TFF1e 进行 IP-MASS 实验，拉取到了 YTHDC1 这个蛋白，体外 RNA pulldown 实验进一步验证了 IP-MASS 实验的结果，TFF1e 这个 eRNA 可以被 YTHDC1 结合。YTHDC1 的 RIP-qPCR 实验验证了 YTHDC1 结合含有 m6A 修饰的 eRNA：

YTHDC1 的 ChIP-seq 实验结果发现 YTHDC1 的结合 peaks 有 61.1% 位于 enhancer 上，对于 YTHDC1 的结合 peaks 区域，BRD4、MED1、P300 等活性标记也有结合。BRD4 与 YTHDC1 有很高的相关性，YTHDC1 对于含有 m6A 修饰的 eRNA 结合强度更强。

作者又使用 LNA 去敲低特定的 eRNA 如 TFF1e，发现 YTHDC1 对于 TFF1e 的结合也显著下降了：

同样，在敲低 METTL3/METTL14 以后，YTHDC1 对于它结合 peak 的能力也减弱，对于含有含有 m6A 修饰的 eRNA 结合强度减弱的更低。

作者又使用了 dCasRx 融合 FTO 靶向去除特定 eRNA 上的 m6A 修饰技术，发现去除 eRNA 上的 m6A 修饰后，YTHDC1 对其结合能力显著下降：

作者还使用了 YTHDC1 的抑制剂 compound 11 化合物抑制 YTHDC1 的 m6A 结合活性，可以看到，在抑制 YTHDC1 活性后，YTHDC1 对其结合能力也是显著下降的：

然后作者敲低了 YTHDC1，发现在 YTHDC1 敲低的细胞系中，YTHDC1 对 eRNA 的结合能力也是显著下降的。稳定性实验表明，YTHDC1 敲低后并不影响对 eRNA 的稳定性，说明作用是发生在转录水平的。

使用 E2 或 EGF（表皮生长因子）诱导产生的 eRNA，在 YTHDC1 敲低的条件下，对应的 RNA 水平都发生了显著下降，对于非这些因子诱导产生的 eRNA 却没有显著性变化：

此外，作者还做了 YTHDC1 的回补实验，结果显示只有在回补野生型的 YTHDC1，而不是 YTHDC1 关键氨基酸突变（和 m6A 结合相关的），才能有效恢复 eRNA 的 RNA 水平，使用 YTHDC1 的抑制剂处理也是类似的现象：

GRO-seq 和 TT-seq 结果，在 YTHDC1 敲低后，对于 E2 诱导产生的 eRNA，这些 eRNA 的转录水平发生了显著下调，在敲低 METTL3/METTL14 的结果也是类似的现象：

作者在 YTHDC1 第一个外显子前敲入了 HALOTAG，构建了融合蛋白，在加入 PROTAC3 后，可以降解 HALOTAG 连接的 YTHDC1 蛋白，在这个系统里，实验结果表明，在降解 YTHDC1 蛋白后，eRNA 的转录水平也发生了显著性下降，TT-seq 和 PRO-seq 结果同样也是类似的现象：

4、YTHDC1 和 m6A-eRNA 形成液滴样凝聚物，促进 BRD4 凝聚的形成

作者分析了 YTHDC1 的序列，发现其含有两个 IDR 序列（IDR 序列和相分离形成有关），于是构建了不同截断型的蛋白，液滴形成实验表明，只含有 YTH 和 IDR1 的蛋白是不能形成液滴的：

在 YTHDC1 第一个外显子敲入了绿色荧光蛋白，FRAP（荧光漂白恢复）实验进一步证明 YTHDC1 能够形成动态的液滴：

作者又在体外纯化了三个类型的蛋白（全长型，YTH，YTH-IDR2），但作者并没有纯化出全长型的 YTHDC1 的蛋白，因为 YTH-IDR2 和全长型的 YTHDC1 形成液滴的能力相近，作者就用了 YTH-IDR2 做后续的体外实验。

只有在含有 m6A 修饰的 TFF1e 里才能形成明显的荧光，而对于 YTHDC1 的 R（精氨酸）突变为A（丙氨酸）和 YTH 的蛋白来说没有变化。此外随着蛋白浓度增加，荧光强度也逐渐增加：

固定蛋白浓度，逐渐增加 m6A-TFF1e 的浓度，荧光强度也逐渐显著性增强。作者发现 YTHDC1 的氨基酸序列富含 R（精氨酸）：

之前有报道 BRD4 也能形成相分离结构，作者猜想是不是也参与了 YTHDC1 结合 eRNA 这样形成相分离的过程中。

发现敲低了 YTHDC1，BRD4 在增强子上的结合能力减弱了，作者于是在 BRD4 敲入了 mCherry 红色荧光蛋白构建了融合蛋白。发现敲低了 YTHDC1 后，BRD4 的荧光显著减弱：

同样，敲低 METTL3/METTL14 后，BRD4 的荧光也显著减弱，使用 BRD4 的抑制剂 JQ1 抑制 BRD4 活性后，结果类似。荧光共定位实验表明 BRD4 和 YTHDC1 和 m6A-TFF1e 发生共定位。最后在三者加入如情况下形成的荧光是最强的。

5、结论