经纬行研 | 柳暗花明又一村：siRNA药物的诞生之路（下）
经纬行研上一期“柳暗花明又一村：siRNA药物的诞生之路（上）”，从发现历史、作用机制、化学修饰、递送系统方面对siRNA药物进行了详细介绍，本期行研将对siRNA药物开发进行介绍。
一、siRNA药物的开发历程
RNAi技术的特异性、高效和简便性使得siRNA药物迅速成为最流行的基因调控工具。2001年，RNAi技术被《科学》杂志评为2001年的十大科学进展之一。2002年斯坦福大学的Mark Kay在Nature上发文证明人工合成的siRNA可以在小鼠上有效降低目标基因的表达，这让制药界意识到siRNA在临床应用的可能性。后基因组时代和RNAi技术的突破，让人们觉得“程序化”制药的梦想越来越近。
图1 布局siRNA药物的主要药企
初期，在RNAi领域积累了大量专利的siRNA生物科技公司Alnylam和Sirna迅速成为MNC眼中的明星。随之而来的是siRNA药物的开发在2006年达到第一次繁荣。这期间的标志性事件包括诸如当年的诺贝尔生理或医学奖颁给了发现RNAi的Fire和Mello；默沙东用11亿美金收购了Sirna；武田、罗氏和诺华纷纷与Alnylam签署巨额合同等。但在随后的几年内，siRNA药物由于递送和免疫反应的问题屡遭挫折。2010年，诺华和罗氏中止了Alnylam的合作，随后辉瑞和雅培也中止了自己的RNAi项目。默沙东坚持多年后，于2014年将Sirna以低于原收购价20%的价格卖给了Alnylam。这些事件给业界传递了一个消极的信息，即siRNA只能作为研究工具，成药之路困难重重。
山重水复疑无路，柳暗花明又一村，正当业界逐渐失去信心之际，siRNA技术取得了一系列突破而重新崛起。
首先是2010年加州理工大学的一项研究证明了siRNA能够进入肿瘤组织，证实了在人体的有效性。Alnylam和Dicerna等公司通过裁员等措施度过了最艰难的时期。2013年，Alnylam公司还在新英格兰杂志上发表了patisiran安全有效的临床数据。Arrowhead从2011年到2015年借机收购了大量别人放弃的RNAi资产。自2018年起，MNC开始大肆收购siRNA资产，预示着siRNA药物迎来了第二次浪潮。这一年第一个siRNA药物--美国Alnylam公司的Onpattro（patisiran）获得美国食品药品管理局(FDA)批准上市，用于治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性引起的神经损伤。除此之外，Alnylam研发的全球第二款siRNA药物Givlaari于2019年11月20日获批，也是全球首个GalNAc偶联siRNA疗法，用于治疗年龄在12岁及以上的急性肝卟啉症（AHP）患者，被授予突破性药物资格和孤儿药资格。这也标志着精密基因药物开发的一个重大里程碑。美国Quark制药公司也正在研发针对治疗脉络膜心血管形成导致的黄斑变性，以及心血管手术后的急性肾损伤等疾病的siRNA药物。2020年12月12日，诺华宣布其siRNA疗法Leqvio（inclisiran）已获得欧盟委员会的批准，用于治疗成人高胆固醇血症及混合性血脂异常。
可以看出，由于RNAi是生物体内自然发生的现象，siRNA药物被大家认为拥有非常好的成药潜力，多家企业在进行siRNA药物的研发。目前，siRNA药物已有四个获批，至少8个处于三期，17个二期，33个一期，如表1所示。除上述获批的4款药物外，尚有多款siRNA药物在研发中。包括一款有望实现三个月注射一次的降压药ALN-AGT01、每月注射一次的血友病治疗药物Fitusiran、以及有望实现乙肝功能性治愈的药物JNJ-3989和VIR-2218等。
从适应症的角度来看，目前处于临床阶段siRNA药物在适应症方面主要集中于癌症、慢性疾病、部分罕见病等疾病领域，其中以实体瘤、胰腺癌、高草酸尿症、肝肾疾病居多，如表2所示。
表1 siRNA药物临床试验阶段分布情况
表2 siRNA药物临床适应症分布情况
二、siRNA药物开发代表性公司
Alnylam所采用的递送系统包括LNP、GalNAc等，已经获批的Patisiran采用LNP递送系统，而Givosiran、Lumasiran、Inclisiran采用GalNAc递送技术，同时公司也在开发新一代的GalNAc(ESC+)技术，以增强药物的特异性和治疗窗口。除肝脏递送外，Alnylam也在研发将药物递送至脑部、脊髓和眼部的递送技术。Alnylam在多方面布局了专利，包括分子结构、用途、化学修饰、递送系统等。
Alnylam的增强稳定化学（Enhanced Stabilization Chemistry，ESC）递送技术平台通过对RNAi疗法的RNA片段进行GalNAc化学修饰，不但提高其稳定性，而且可以促进RNAi疗法的肝脏靶向递送。这一技术在Givlaari上首次得到应用。然而，这种疗法仍然有可能在肝脏沉默其它非靶点基因，从而导致肝脏毒性的发生。Alnylam的研发人员发现，RNAi脱靶效应的一个主要原因是与靶点mRNA结合的siRNA序列中的一部分片段可能起到像miRNA一样的功能，它们可以与其它mRNA的3端非转录区（3ʹ UTR）相结合，抑制mRNA的转译和稳定性。为了减少这一“脱靶效应”，研究人员在RNA片段中故意添加了一个乙二醇核酸（Glycol Nucleic Acid，GNA）。加入GNA能够在维持RNAi与靶点结合的特异性同时，降低了它与脱靶位点的结合能力，进一步提高了RNAi疗法的特异性和安全性。Alnylam将这一技术称为ESC+技术。
表3 Alnylam公司研发管线汇总
目前，基于这一技术，Alnylam公司的研发管线中已经有超过15个临床前研发项目，治疗中枢神经系统、眼科和肺部疾病。其中包括通过降低APP蛋白的表达，治疗早发性阿尔茨海默病患者和遗传性脑淀粉样血管病的ALN-APP，以及与Vir公司合作，治疗COVID-19的多款RNAi疗法。
该公司的研发项目从1期临床进展到3期临床试验结果积极的成功率达到59.2%，远远高于行业平均值。这是因为所有的研发项目都基于人类遗传学验证过的靶点，而且生物标志物的使用是所有研究项目的一部分。一旦克服毒副作用和递送手段方面的挑战，成功开发RNAi疗法反而变得相对简单。
展望未来，Alnylam的目标是进一步扩展RNAi这一治疗模式的应用范围，从目前的罕见疾病扩展至专科疾病，以及常见疾病。到2025年，Alnylam有望成为拥有6款以上获批疗法，10多个后期临床开发项目的全球5大独立生物技术公司之一，为更多患者造福。
Dicerna开发的名为GaIXCTM的专有RNAi技术平台，能够沉默肝脏中的疾病基因。Dicerna科学家将N-乙酰半乳糖胺糖直接连接到专有的Dicer底物短干扰RNA(DsiRNA）分子的延伸区域。除利用GalNAc将药物递送至肝脏外，公司也在研发其他的递送系统，如小分子化合物、短肽、Fab片段等，将药物递送至中枢神经系统、骨骼肌、脂肪等组织中。
2017年，Dicerna与勃林格殷格翰合作开发非酒精性脂肪性肝炎（NASH）药物。NASH是一种目前还没有疗法可用的严重疾病，由肝脏脂肪堆积所引起，可能会导致肝纤维化及肝硬化，后者通常需要进行肝移植。2019年，两家公司合作第二个靶点。
2018年，Dicerna与亚力兄制药达成合作。根据协议，亚力兄和Dicerna将台作开发皮下递送的GaIXC-RNAi分子，这些分子针对两个补体途径靶点，用于治疗补体介导的疾病。Dicema将获得2200万美元的预付款，1500万美元的股权投资，以及高达1.05亿美元的里程碑款项。
同年，礼来与Dicerna达成一项全球许可和研究合作，双方将利用Dicerna专有的GalXCTMRNAi技术平台，开发心脏代谢疾病、神经变性和疼痛领域的新药，将靶点推向临床。根据协议，Dicema将获得1亿美元的预付款，以及1亿美元的股权投资。此外，Dicema也有资格在开发和商业化过程中获得高达3.5亿美元的里程碑付款，以及产品的销售分成。
Dicema的在研新药是DCR-PH，针对肝乳酸脱氢酶基因。乳酸脱氢酶参与草酸的合成，DCR-PH减少草酸台成，用于治疗原发性高草酸盆尿症。原发性高草酸盐尿症是一种严重的、罕见的遗传性肝疾病，缺乏治疗方法，50％的患者在30岁时都会发生终末期肾病。DCR-PH目前已经开始进行临床研究。
另外，Dicerna与罗氏合作研发了一种针对罕见肝病的候选产品，处于一期临床试验阶段的用于治疗慢性乙型肝炎病毒（HBV）的DCR-HBVS（RG6346）。该公司还开发了一种靶向β-连环蛋白致癌基因的全资临床候选药物DCR-BCAT。DCR-BCAT通过其脂质纳米颗粒（LNP）肿瘤递送系统EnCore递送。
表4 Dicerna公司研发管线汇总
在国内，siRNA药物已经被列入“十四五”生物产业发展规划的重点发展领域。国内siRNA药物开发领域也涌现出一批以瑞博生物为代表的优秀核酸药物公司。
瑞博比较吸引眼球的是其与国外核酸药物领军企业进行的跨国合作。早在2012年，瑞博生物就与夸克制药合作建立了合资公司RiboQuark（昆山瑞博夸克医药科技有限公司），并于2014年1月在中国提交了siRNA药物QPI-1007的临床试验申请，这是一项治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变的国际多中心2/3期关键性临床试验，于2015年获批，已在中国首都医科大学附属北京同仁医院由王宁利教授的团队完成首例受试者给药。QPI-1007是一种人工合成的siRNA，旨在暂时抑制促凋亡蛋白半胱天冬酶2的表达。该研究是在中国进行的首个siRNA药物的临床试验，该受试者也成为中国首例接受小核酸药物治疗的患者。其他适应症如青光眼的研究也在开展中。苏州瑞博生物拥有该药物在中国及亚洲（少数特定国家除外）的开发和市场权益，该研究是国内进行的首个siRNA药物临床实验。2013年，瑞博与美国Life Technologies Corporation就新一代小核酸递送技术达成专利转让协议，瑞博获得该技术在中国的研发和生产的独占许可权利。Life Technologies曾是全球最大的生物技术企业（后被ThermoFisher公司收购），也是小核酸递送技术领域的先行者，其体内、体外核酸递送试剂占到国际小核酸转染市场的70%。这是对瑞博的核酸药物递送技术平台的一次有益补充，也为瑞博的诸多项目向临床推进提供了非常好的支撑。此外，瑞博生物通过与全球核酸制药领先企业美国Ionis Pharmaceutical的合作，获得了后者三个用于治疗代谢疾病和癌症的反义核酸药物品种。瑞博生物已经申请70余项专利，其中30余项获得授权，涉及针对多种致病基因的siRNA及相关制剂、治疗应用、给药载体、核苷酸及寡聚核酸分子的工业化制备方法等。目前，瑞博的产品管线覆盖了乙肝、高血脂、肝癌、视神经损伤等多个领域，其中针对2型糖尿病、前列腺癌和NAION产品已进入II/III期临床阶段。
瑞博开发了siRNA液相合成技术，并且已经提交了多项这方面的专利申请，其中一项已在中国、美国、欧洲和日本获得授权。通过与许多国内外科研单位和国际生物技术和制药公司的合作，瑞博评估、开发了多种siRNA递送系统，诸如脂质体、高分子聚合物、树形高分子、人造大分子、蛋白和多肽聚合物等。尤其是一种基于脂质纳米颗粒开发的肝靶向递送系统，保证了目前系统性递送siRNA药物开发。生物活性评估表明其具有高效的递送能力和优越的体内持续作用能力，且在动物模型试验中，其不会引起体内免疫应答反应，对肝肾功能无明显的影响。
表5 瑞博生物研发管线汇总
表6 圣诺制药研发管线汇总
圣诺制药拥有自己的核酸药物递送技术平台——PNP(peptide nanoparticles)，PNP是核酸类药物的体内运送载体，是由人工合成的组氨酸和赖氨酸的多肽共聚物(HKP)。组氨酸和赖氨酸按照体外设计，人工合成为分枝状多聚物HKP，在水溶液，HKP多肽分子中的赖氨酸的氨基与核酸分子中的磷酸基通过离子键相互作用而结合（包括分子间的疏水键等其他相互作用）自组装形成一定大小的纳米颗粒。药物纳米颗粒通过细胞的内吞作用进入细胞。在内含体内，由于酸性增强，促使弱碱性的组氨酸开始质子化，进而导致内含体膜溶解，释放内含的小干扰核酸分子。圣诺制药集团通过长期的努力，采用先进的微流控技术，现已完成PNP药物的工业化生产过程，并在临床试验中取得较好成果。同时，公司也在原有递送技术平台上不断扩充，目前拥有包括PDov-GalNAc在内的多种递送系统，圣诺与NIH、NAVY MRC、Johns Hopkins University、Duke University等机构展开合作，推动了产品开发和临床前项目，推进了临床发展战略。
苏州圣诺目前已布局数十条siRNA产品管线，适用于多种适应症，其中以STP705、STP707两个项目进度较为突出。STP705及STP707均为针对转化生长因子-β1（TGF-β1）和环氧化酶-2（COX-2）双靶点核酸干扰药物。该两靶点均具有诱导组织细胞生长和转化的作用，与肿瘤的发生、发展有密切的关系。TGF-β1是一种多功能生长因子，在肿瘤、脏器纤维化、创伤修复、炎症性疾病及自身免疫性疾病等发生发展中有着重要的功能。在病理情况下，COX-2的高表达通过抑制细胞凋亡、促进新生血管的形成帮助肿瘤细胞逃逸机体免疫监视等多种作用促进肿瘤的发生及发展。所以两种产品针对两个靶点双管齐下进行siRNA设计，通过多肽（组氨酸和赖氨酸的多肽共聚物）纳米颗粒载体，针对病灶局部注射以实现递送，特异性抑制病灶中TGF-β1及COX-2基因表达，从而实现病灶的减少或根治。
目前STP705适应症包含非黑色素瘤皮肤癌（NMSC）、胆管癌、膀胱癌和增生性瘢痕等，该候选药已获得美国FDA和中国NMPA多项临床试验（IND）许可，其用于治疗胆管癌、肝细胞癌和原发硬化性胆管炎的临床指症已获得美国FDA“孤儿药”认证。用于治疗NMSC及增生性瘢痕已进入临床II期，2020年12月21日，苏州圣诺公布其主要候选药物STP705治疗皮肤鳞状细胞癌的2a期临床试验取得了安全高效的治疗结果。该临床2a期试验的成功显示出核酸干扰药物在肿瘤治疗应用中具有巨大的潜力，一定程度上验证了多肽纳米颗粒载体递送系统的安全性，双靶点协同抑制则是STP705项目的绝对优势。siRNA针对病源基因可程序化设计的特点，让研发过程具有更大的空间。苏州圣诺下一步计划针对皮肤鳞状细胞癌开展临床IIb期试验，并扩大适应症范围，进一步确认药物的有效性、安全性及多肽纳米颗粒递送系统的稳定性，结果值得期待。STP707项目靶点机理与STP705项目类似，目前研究数据显示，当与PD-L1mAb或吉西他滨联合应用时，能显著增强肝癌/胆管癌（HCC/CCA）治疗效果。
三、总结
核酸药物有望成为继小分子化药和抗体药物后的第三大类型药物。与传统药物不同，siRNA通过介导转录后基因沉默，理论上可以从根本上治愈疾病。但其不稳定性、免疫原性、细胞摄取效率低、内吞体逃逸难等缺陷曾限制了核酸药物的发展。在经历了2005~2008年的高潮、2008~2012年的低谷之后，关键技术的突破对改善上述缺陷发挥了重要作用，siRNA药物进一步在罕见病、肿瘤疾病领域散发出勃勃生机。
1、高疗效和长疗效。好的载体能使治疗基因在细胞内长期稳定表达治疗蛋白，从而达到一劳永逸的效果，而传统药物代谢快，需经常服用；
2、副作用少。与传统药物的全身性作用相反，基因治疗药物的靶向性极强，可特异性地作用于某类组织及细胞上；
在肿瘤药物领域，siRNA同样有其一席之地。在过去的几十年里，人们在肿瘤的检测、预防和治疗方面做出了巨大的努力，但肿瘤信号通路的复杂性、微环境的异质性和转移因素仍然是目前癌症治愈之路上最大的挑战。目前使用的治疗方法是非选择性的，可能会产生副作用，使得康复时间增加、医疗成本增加。而大多数癌症是由癌基因过度表达或基因突变引起的，因此通过合理的siRNA设计，可以通过有针对性地抑制疾病相关的基因来治愈癌症，目前siRNA药物临床适应症超30%为癌症。因此，针对性更强的siRNA技术可以为癌症诊断工具和治疗方法提供新的可能性。
在Alnylam的ONPATTRO走出了第一步之后，目前已有接连四款siRNA产品获批，这大大提高了人们对未来治愈基因类疾病的信心。也许有一天，随着技术的不断改进，我们能“敲除”所有致病基因，来消除不治之症，如早衰症、系统性红斑狼疮、阿尔茨海默病、恶性脑瘤和许多其他疾病。（完）
参考文献：
往期回顾
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图文编辑 | 彭庶文
文章撰写 | 高超、吴昊、刘啸波、焦瑞、程遥、王盼、魏欣、马晴晴