免疫荧光入门必备｜万事屋带你解锁这项实验技能

我穿越万千星火⭐

只为找寻你的踪迹

实验中有了你💖

便若荧墨点亮银河，拨开长夜

若失了你🖤

便却烛光寂灭，有眼如盲，不知所行

今天，为大家介绍生物实验中应用广泛，举足轻重的一项细胞标记示踪技术。

免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）是利用抗原抗体反应的高特异性、高敏感性为基础，联合荧光色素标记，对细胞或组织内特定的物质进行标记或示踪的一种实验技术，也是标记免疫技术中发展最早的一种实验技术；目前应用极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物等各种生物活性物质。

目前根据免疫荧光抗体技术不同的检测原理，通常分为两类：

直接免疫荧光法（direct immunofluorescence assay）利用荧光素标记抗体直接于待测样本上的抗原进行特异性反应，从而检测标本抗原。此方法操作简单、特异性高、但敏感性偏低，检测每一种抗原需要响应的荧光素标记抗体。

间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay）利用基质中的相应抗原与待测样品中的一抗进行反应后，加入荧光标记的二抗，从而检测样本中的抗体。此方法常用于检测样本中的未知抗体，敏感性比直接免疫法高5~10倍，因此运用更加广泛。

大家可以根据示意图来更好的理解

标记荧光素是一种吸收激发光作用后产生荧光，并能作为一种染料使用的有机化合物，目前常用的标记荧光素及性质见下表。

常用的标记荧光素及性质

下面以间接免疫荧光法为例，看一下整个实验流程

荧光免疫技术在当今的科学研究中，主要运用于

（1）研究特异蛋白抗原在细胞内分布

（2）对抗原进行细胞定位

（3）对特定抗原进行定量检测

下面是一个细胞共定位的例子,蓝色的是细胞核，绿色对应的是蛋白A，红色是蛋白B，通过多重免疫染色，可以分析两种不同蛋白的空间和相互作用关系。这种多重染色相对于单染色来说，难度更大，主要是在一抗和二抗的选择上，多重染色实验有更加苛刻的限制，首先进行多重染色的前提条件是，使用的各一抗种属来源不能相同；其次为了防止不同种属来源的二抗发生交叉反应以及生成较高的背景，二抗的种属来源需要相同。

免疫荧光的照片，不仅可以做形态学分析，还能通过imagej等软件得到它的平均荧光强度，从而对特异性蛋白表达进行半定量的分析。

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