知识分享 || 荧光成像在小鼠多模型中的应用
活体荧光成像是研究动物组织，肿瘤检测及治愈的重要检测方法，其在生物学和医学领域都发挥着不可或缺的作用。活体荧光成像技术能够无创伤定量检测小鼠的皮下瘤模型，相对于生物发光成像技术等，活体荧光成像技术检测时间较快，同时不需要注射底物，节约了检测成本。因此分享了活体荧光成像在多领域的应用及模型的构建。
1.脑组织及肿瘤血管模型
图1.用BTPETQ点标记的小鼠脑血管网络的活体成像[1]
可以利用具有长波吸收和聚集诱导近红外(NIR)发射的高亮度荧光团(BTPETQ)，用于在NIR- II光(1200 nm)激发下对小鼠脑和肿瘤血管进行活体双光子荧光(2PF)成像。将BTPETQ点注入血液后，对正常耳组织和肿瘤组织的血管进行2PF成像。从图1可以看出由于BTPETQ点在血管中流动时，肿瘤血管结构渗漏和曲折血管的异质性增加，被血管壁“吸”，点的聚集导致荧光增强，从而区分了深度脑组织和肿瘤血管。
2.胃肠道成像模型
图2. P3灌胃后小鼠腹腔开腹后的时间依赖性活体荧光成像
及肺、肝、脾、肾、心解剖器官的荧光成像[2]
高时空分辨率胃肠道成像与传感技术在胃肠道疾病诊断和靶向药物开发中具有重要意义。如胃酸环境异常、胃肠排空过程异常等临床常见病都需要胃肠影像学和生物医学分析才能准确诊断。如图2可以利用修饰了3-羟甲基化合物的吡咯（P3)）在酸性缓冲溶液和体内胃中快速转化为近红外发射的自由基阳离子（P3•+），在胃内产生深红色荧光信号，检测荧光信号强度，从而用于高时空分辨率的活体胃肠道成像，和胃排空过程的动态监测和抗胃酸治疗的评估。
3.肝脏成像模型
图3.基于荧光法检测小鼠肝组织中FAO的活性[3]
脂肪酸β-氧化（FAO）是脂质分解代谢的关键过程。肝脏中FAO的异常活性与肝癌和非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等疾病相关。可以使用探针检测小鼠肝脏中的FAO活性，探针在脂肪酸单元上被FAO酶截断，最终释放苯酚，苯酚通过1,6-氟离子消除自发转化为反应性醌甲基（QM），释放的QM将被细胞内蛋白共价捕获，并与其炔反应柄上的荧光团进行生物正交连接，从而对FAO活性进行荧光评估。小鼠腹腔注射探针，1h后处死，取肝脏样本。切片后用TAMRA-叠氮化物处理肝切片，并进行荧光成像。图3中可以看出在整个切片区域都观察到TAMRA的明亮荧光。
4.肿瘤转移的高灵敏度成像
图4.基于M2样巨噬细胞靶向和极化的淋巴结
转移性肿瘤的体内NIR-II成像[4]
与肿瘤相关的巨噬细胞，特别是M2样的巨噬细胞，广泛参与肿瘤的生长和转移，抑制先天免疫，帮助肿瘤细胞逃逸。通过设计靶向一氧化氮响应探针（NRP@M-PHCQ）跟踪M2样巨噬细胞的极化，敏感地监测和抑制早期肿瘤转移，并从视觉上揭示了M2样巨噬细胞在早期肿瘤中的转移。在静脉注射NRP@M-PHCQ后，对淋巴结转移性肿瘤进行体内NIR-II荧光成像。图4看出足垫注射部位附近的原发性淋巴结（左）在24 h时开始发光，而对侧淋巴结（右）的荧光信号在48 h时出现，并逐渐增加，揭示肿瘤的转移。
5.肿瘤免疫治疗的实时成像和尿液分析
图5.免疫反应的体内实时成像以及免疫治疗的治疗[5]
免疫激活的实时成像对于癌症免疫治疗和药物的发现至关重要，通过合成了可再生的近红外（NIR）荧光大分子报告基因，以特异性检测一种免疫激活相关的生物标志物（颗粒酶B），用于实时评估癌症免疫治疗。从图5中可以看出小鼠经S-（2-硼乙基）-L-半胱氨酸盐酸盐处理不同时间后，将报告基因CyGbPF或CyGbPP静脉注射到活小鼠体内进行NIRF成像，并收集尿液进行光学尿液分析。
6.肿瘤成像
图6.4T1荷瘤小鼠的体内生物正交NIR成像[6-7]
利用生物正交激活的扭转诱导解聚染料用于体内肿瘤成像，经过生物正交反应后，所产生的染料向聚集的趋势减少，导致TIDA诱导的荧光增强，图6中早在5 min时，肿瘤部位就能清晰地观察到荧光信号。
7.小鼠的神经元活性成像
图7.用BRIC或OCaMBI110aav转导的
活鼠海马的代表性生物发光图像[8]
细胞内Ca2+已被用作神经元活性的代表，因此可以利用一种荧光素酶原底物和一种红色的生物荧光钙指示物对小鼠神经元活性进行成像。图7中将荧光钙指示物（BRIC）和橙色CaMBI 110立体定向注射到BALB/cJ小鼠的海马中，就可以对小鼠神经元进行成像。
8.小鼠的生命周期成像
图8.ZW800-1C在小鼠中的体内荧光寿命成像[9]
阿尔茨海默病（AD）是一种致命的神经退行性疾病，其特征是进行性认知障碍和神经退行性变。该疾病的标志性神经病理学特征是由淀粉样蛋白-β肽聚集形成的细胞外老年斑和由tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结（NFTs）。利用两性离子七聚乙氨基荧光团（ZW800-1C）标记淀粉样蛋白-β和tau蛋白聚集物。使用基于时间相关的单光子计数技术的体内共聚焦显微镜和荧光寿命成像显微镜（FLIM）来确定ZW800-1C是否发生与AD病理结合后的寿命变化。将ZW800/1C静脉注射给小鼠，代表性荧光寿命图像从图8可以看出。
参考文献
[1]NIR‐II‐excited intravital two‐photon microscopy distinguishes deep cerebral and tumor vasculatures with an ultrabright NIR‐I AIE luminogen[J]. Advanced materials, 2019, 31(44): 1904447.
[2]In Situ Generation of Red‐to‐NIR Emissive Radical Cations in the Stomach for Gastrointestinal Imaging[J]. Advanced Materials, 2023: 2209940.
[3]Uchinomiya S, Nagaura T, Weber M, et al. Fluorescence-Based Detection of Fatty Acid β-Oxidation in Cells and Tissues Using Quinone Methide-Releasing Probes[J]. Journal of the American Chemical Society, 2023.
[4]Highly Sensitive Imaging of Tumor Metastasis Based on the Targeting and Polarization of M2-like Macrophages[J]. Journal of the American Chemical Society, 2023.
[5]Near-infrared fluorescent macromolecular reporters for real-time imaging and urinalysis of cancer immunotherapy[J]. Journal of the American Chemical Society, 2020, 142(15): 7075-7082.
[6]Bioorthogonally activatable cyanine dye with torsion-induced disaggregation for in vivo tumor imaging[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 3513.
[7]Activatable Persistent Luminescence from Porphyrin Derivatives and Supramolecular Probes with Imaging‐Modality Transformable Characteristics for Improved Biological Applications[J]. Angewandte Chemie, 2022, 134(24): e202116174.
[8]A luciferase prosubstrate and a red bioluminescent calcium indicator for imaging neuronal activity in mice[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 3967.
[9]Near-infrared fluorescence lifetime imaging of amyloid-β aggregates and tau fibrils through the intact skull of mice[J]. Nature biomedical engineering, 2023: 1-11.
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