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编译：不二，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
抑郁症是一种常见的疾病，女性的发病率是男性的两倍。在这里，研究人员发现一类调控转录物-长非编码RNA（lncRNAs），约占抑郁症患者大脑中差异表达基因的三分之一，并显示出复杂的区域和性别特异性调控模式。研究人员揭示了灵长类特有的神经元富含的基因LINC00473，在抑郁女性而不是男性的前额叶皮层（PFC）中下调。利用病毒介导，在成年小鼠PFC神经元中表达LINC00473，研究人员仅在雌性小鼠中诱导应激恢复来重现人类性别特异性表型。这种性别特异性表型伴随着雌性小鼠的突触功能和基因表达的选择性改变，结合对培养的人类神经元样细胞的研究，表明LINC00473是CREB效应因子。总之，研究结果确定LINC00473是女性特有的应激恢复的驱动因素，在女性抑郁症中是异常的。
原名：Sex-Specific Role for the Long Non-coding RNA LINC00473 in Depression
译名：抑郁症中长链非编码RNA的性别特异性作用
期刊：Neuron
IF：14.403
发表时间：2020.04
通讯作者：Eric J. Nestler
通讯作者单位：美国西奈山伊坎医学院
DOI号：10.1016/j.neuron.2020.03.023
研究人员以8周龄的C57BL/6J雌性和雄性小鼠、抑郁症患者和对照组的人类死后大脑样本以及体外培养的神经前体细胞（NPC）为研究样本，结合RNA测序及小鼠慢性应激模型，揭示了lncRNA在人类抑郁症中的显著性别调控作用，结果使用RNA纯化分离染色质（ChIRP）、RNA荧光原位杂交（FISH）及实时荧光定量PCR（qPCR）等进行验证。为了探讨lncRNA在抑郁症中的潜在作用，研究人员使用了约50名抑郁症患者和对照组的人类死后大脑样本中生成的全基因组RNA测序（RNA-seq）数据集。在这个数据集中，研究人员分析了以下六个脑区的转录组：腹内侧PFC（vmPFC）、背外侧PFC（dlPFC）、眼窝前额皮质（OFC）、伏隔核（NAc）、前脑岛（aINS）和腹下室（vSUB）（图1A）。研究人员之前已发表的分析集中在蛋白编码基因（PCG）上，这里研究人员把注意力转向了lncRNA。研究人员首先检查了大脑区域内调控基因的生物型，发现lncRNA在男性和女性抑郁症患者中约占差异表达基因的30%（图1B）。异常表达的lncRNA主要是反义和lincRNA两种生物型。接下来，研究人员比较了六个大脑区域中差异表达的lncRNA，并注意到两性的大脑区域特异性差异表达模式（图1C和1D）。lncRNA的亚群在多个脑区也有类似的调控，但其他区域则相反或者不调控，甚至不表达。研究人员比较了不同性别之间lncRNA在抑郁症中的调控模式，并注意到不同性别之间lncRNA在同一性和方向性上的极小重叠（图1E和1F）。值得注意的是，在大多数脑区，女性抑郁症中调控的lncRNA数量较多，男性和女性抑郁症中调控的lncRNA之间只有约3%的重叠。研究人员在rACC样本的RNA测序数据中进行了差异表达基因分析，并鉴定了许多lncRNA，两性间的调控lncRNA重叠非常小（0.5%）。这些发现表明lncRNA高度调控抑郁症的病理生理学和性别特异性。
为了进一步探讨与抑郁症相关的关键lncRNA，研究人员对数据集中的性别间lncRNA和PCG的表达水平进行了相关分析。协同表达的lncRNA和PCG转录本可能参与共同的生物学过程。研究人员发现女性大脑中相关的lncRNA-PCG数量高于男性（Wilcoxon检验：Z=-2.20558，p=0.0274），表明女性的lncRNA-PCG相互作用更强。为了确定关键的lncRNA靶点，研究人员根据以下四个参数筛选出与PCG相关的lncRNA列表：（1）丰度（所有样本中平均至少有一个读数）；（2）抑郁症中的差异表达（倍数变化>30%，p<0.05）；（3）神经元中的富集程度；（4）神经前体细胞（NPC）的表达（图2A）。结果表明LINC00473在女性大脑中与35个PCG显著相关，在抑郁女性的几个脑区中表达强烈，并在NPC中表达下调。一些与LINC00473相关的PCG已报道与抑郁症有关，包括ARC、NR4A1、EGR1、EGR2和DUSP6。此外，在女性而非男性中，LINC00473在抑郁症中整个大脑区域下调（图2B）。为了验证RNA测序结果，研究人员对vmPFC样本进行了qPCR，并确认女性抑郁症患者的LINC00473下调，而在男性中只出现微弱趋势。此外，研究人员对一个独立的RNA测序数据集的分析证实，LINC00473在女性而非男性抑郁症患者的rACC中下调（t=-2.629，p=0.008）（图2C）。最后，研究人员使用RNA荧光原位杂交（FISH）在rACC中证实了这种性别特异性调控，与对照组相比，仅抑郁女性的LINC00473表达下调。LINC00473只在灵长类动物中表达，在啮齿动物中没有明显的同源表达。它位于人类第6号染色体上，并在人脑和其他几个器官中表达。在大脑中，LINC00473主要表达于中等水平的神经元，主要表达于谷氨酸能锥体神经元，并在细胞核内富集（图2E和2F）。在已发表的数据集或对照受试者的大脑中，LINC00473的表达水平没有基线性别差异。有趣的是，研究表明，LINC00473是由cAMP和CREB信号以及人源性培养细胞的神经元活动强烈诱导的。另外，LINC00473还没有在神经精神综合征或性别差异研究中进行探讨。
LINC00473在小鼠PFC神经元中的表达对雌性小鼠行为、生理和转录的影响为了验证LINC00473在抑郁症中的因果作用，研究人员利用了小鼠慢性应激模型，尽管LINC00473在啮齿动物中不正常表达，但其表达可能诱导同源功能，从而调控抑郁症相关的行为反应。值得注意的是，这种利用小鼠研究灵长类特异性lncRNA作用机制的方法在肝脏和心脏代谢特性方面是卓有成效的。利用表达LINC00473和eGFP（LINC00473）或仅表达eGFP（GFP）的HSV病毒，立体定向导入成年雄性或雌性小鼠的mPFC中。在两性中诱导了相似程度的LINC00473的表达。由于LINC00473在人类女性抑郁症中下调，研究人员推测在雌性小鼠中表达LINC00473可以促进应激恢复。为了验证这一假设，研究人员使用慢性社会挫败应激（CSDS），这种应激在雄性小鼠和雌性小鼠中得到了广泛的验证。正如预测的那样，社交失败的雄性小鼠和雌性GFP小鼠表现出社交回避增加，表明社交互动减少（图3B-3D）。研究人员发现，LINC00473只在雌性小鼠中拯救了社会互动（图3C）。研究人员从对照组和CSDS小鼠采集血液，并检测了血清皮质激素（CORT）水平。在LINC00473应激雌性小鼠中观察到的行为弹性与循环CORT水平降低有关，而雄性小鼠没有差异。接下来，研究人员在第二个慢性应激模型慢性可变应激（CVS）中进行验证，其中雌性小鼠比雄性小鼠更敏感（图3E）。在mPFC神经元中表达LINC00473的雌性小鼠与表达GFP的对照小鼠相比，在高架迷宫（图3F）或大理石掩埋实验（图3G）中没有显示出基线差异。然而，表达LINC00473的雌性小鼠在张开手臂上花费更多的时间，并且与应激GFP组相比埋下的弹珠更少。这两种行为都表明焦虑相关行为减少。在最新抑制喂养实验中，由于缺乏食物，基线比高架迷宫或大理石掩埋实验压力更大，研究人员发现表达LINC00473的雌性小鼠表现出最短的进食潜伏期（图3H），表明焦虑和抑郁样行为减少。在雌性小鼠的尾部悬吊实验中也发现了类似的促弹性效应。当研究人员在雄性小鼠身上进行同样的实验时，研究人员发现LINC00473的表达没有影响升高的正迷宫（图3I）、最新抑制喂养（图3K）或尾部悬吊实验，但是研究人员观察到大理石掩埋增加，表明焦虑相关行为增加（图3J）。有趣的是，研究人员发现CVS只导致表达LINC00473的雄性小鼠体重下降。在这两种性别中，LINC00473的表达对蔗糖偏好或强迫游泳测试指标都没有影响。总之，LINC00473在mPFC中的表达对雌性小鼠有促进弹性的作用，而在雄性小鼠中没有。这些结果与研究人员在人类中的发现相一致，即低水平的LINC00473与女性而非男性抑郁症有关。
图3 成年小鼠mPFC神经元中的LINC00473表达仅促进雌性的应激恢复为了探讨LINC00473在mPFC中的表达促进雌性小鼠应激恢复的可能机制，研究人员研究了其对突触功能的影响。利用HSV病毒载体在mPFC神经元中表达LINC00473，然后制备脑切片，并从表达LINC00473+GFP或GFP的mPFC锥体神经元中获得细胞内电生理记录。研究人员发现，与GFP感染或未感染的神经元相比，LINC00473表达降低了雌性大鼠自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的频率（图4A和4B）和振幅（图4C）。相比之下，雄性的LINC00473组和GFP组之间sEPSC没有差异（图4D-4F）。LINC00473的表达对两种性别的膜兴奋性均无影响。这些结果表明，LINC00473选择性地影响雌性小鼠mPFC锥体神经元的突触前和突触后特性，这与LINC00473在控制抑郁和焦虑样行为方面的性别特异性效应相似。
图4 LINC00473表达调控雌性而非雄性小鼠的mPFC锥体神经元中的sEPSC核lncRNA可以通过多种机制调控基因表达，因此研究人员用RNA测序检测了LINC00473在mPFC神经元中的表达。研究人员分析了仅在该脑区表达LINC00473或GFP的雌性小鼠的mPFC中的RNA（图5A）。研究人员发现CVS诱导GFP组中基因表达改变的数量是LINC00473组约5倍（图5B）。这些数据表明，LINC00473的表达显著减弱了CVS在mPFC中的转录效应（图5C），这与CVS在相同条件下在行为水平上的抑制效应相似。研究人员利用基因本体（GO）分析探讨了CVS在GFP和LINC00473组中的调控基因。在GFP组中，GO显示主要与应激反应有关，包括胶质细胞和神经发生的变化（图5D），而在LINC00473表达背景下与CVS相关的GO则非常不同，包括信号受体活性和肽激素结合（图5E）。利用智能信号通路分析法（IPA）寻找GFP组和LINC00473组CVS改变的上游调控基因。GFP组CVS后差异基因表达的预测上游调控因子包括已报道的参与应激调控的因子（图5F），如Rictor，而LINC00473组的上游调控因子包括forskolin和CREB1（图5G）。cAMP-CREB通路在抑郁症中有一定的作用，特别是在mPFC中，并且已经证明LINC00473也是由该通路在培养细胞中诱导的。总之，这些发现表明，在小鼠mPFC神经元中表达灵长类特异基因LINC00473可以影响小鼠对应激的行为反应、mPFC锥体神经元的神经生理特性以及该脑区内的基因表达谱。值得注意的是，RNA-seq数据显示，LINC00473的表达扰乱了人类细胞中看到的保守信号通路（即cAMP-CREB）。
图5 mPFC神经元中的LINC00473表达减弱了由CVS诱导的基因表达变化LINC00473的表达优先改变女性人神经样细胞中的基因转录研究人员接下来研究了LINC00473在细胞中的作用，这些细胞来自男性或女性健康人体的NPC内源表达LINC00473。研究人员使用反义寡核苷酸（ASO），一种可以降低特异性lncRNA（KD）核水平的方法，在研究人员的病例中，以KD-LINC00473为例，模拟其在女性抑郁症中的下调（图6A）。与对照ASO相比，研究人员筛选了多个ASO以确定女性（图6B）和男性细胞系（图6C）中KD-LINC00473表达增强的ASO，然后对样本进行RNA-seq。研究人员发现，在雌性来源的NPC中，LINC00473敲低显著调控的基因是雄性来源的NPC的5倍（图6D）。女性和男性NPC中LINC00473敲低引起的转录变化之间也几乎没有重叠（图6D）。这些数据进一步证明了LINC00473对女性的调控作用大于男性。
图6 人类女性NPC中的LINC00473敲低对基因表达的影响强于男性NPC最后，研究人员为了鉴定人类细胞中LINC00473直接结合的基因。由于LINC00473主要是位于核中（图2E）并调控基因表达（图4和5），研究人员推测LINC00473可能直接与DNA相互作用。因此，研究人员通过RNA纯化分离染色质（ChIRP）并进行DNA测序（DNA-seq）。使用了一种人神经母细胞瘤雌性来源的SH-SY5Y细胞系，该细胞系不同于人类NPC，内源充分表达LINC00473。研究人员用腺苷酸环化酶激活剂forskolin刺激cAMP-CREB信号，测试诱导内源性LINC00473表达的效果。研究人员以特定的方式在对照细胞（DMSO）和forskolin处理的细胞（图7A）中沉淀了大量的LINC00473（图7B和7C）。然后研究人员用LINC00473或LacZ探针对沉淀的DNA进行测序，并将input-DNA作为背景。在DMSO条件下，研究人员确定了LINC00473的结合位点，主要位于基因间区域（图7D）。相反，在forskolin处理的样品中，基因和启动子的结合增强（图7E）。值得注意的是，在forskolin条件下LINC00473与之结合的基因中，普遍存在着与大脑功能相关的基因，特别是与抑郁或焦虑相关的行为（图7F）。这种LINC00473沉淀和抑制相关基因包括编码CREB结合蛋白的基因（CREB-BP），这是CREB和其他转录因子的转录共同激活因子；中心体蛋白350（CEP350），在微管结合中起作用；微管相关蛋白2（MAP2），在发育过程中调控神经发生并在成年期控制树突功能；ERB-B2受体酪氨酸激酶4（ERBB4），是受体酪氨酸激酶EGFR亚家族的成员。接下来，研究人员将ChIRP实验中forskolin条件下结合LINC00473的基因与图6中描述的NPC实验中LINC00473 KD改变表达水平的基因重叠。研究人员发现了一个子集，在LINC00473 KD的雌性NPC中也受到调控，而在雄性NPC中受影响的这些基因明显较少（图7G）。利用HOMER motif分析，研究人员确定了DMSO或forskolin条件下LINC00473基因组结合位点共有的DNA motif。在两种条件下鉴定的motif与已知的转录因子结合motif不一致。此外，DMSO和forskolin条件下与LINC00473结合的唯一重叠是其自身的基因组位点（图7H），表明这种lincRNA具有潜在的自我调控作用。最后，研究人员确定了小鼠基因组中与人类细胞（LiftOver）中LINC00473结合相匹配的位点。这项分析表明，人类细胞中许多由ChIRP识别的位点在小鼠体内具有平行的位点（图7I和7J）。事实上，在forskolin条件下，PCG中25%的LINC00473结合位点在小鼠中是相同的（图7K）。这一分析揭示了小鼠基因组中含有大量的LINC00473与人类基因组结合的同源位点，为研究人员在行为、电生理和分子水平上观察到的LINC00473对小鼠PFC神经元表达的功能影响提供了基础。
图7 内源性LINC00473表达的诱导募集结合与抑郁相关的基因座在这项研究中，研究人员展示了lncRNA在人类抑郁症中的显著调控作用，其复杂的模式见于大脑区域和性别。研究人员确定了一个在抑郁症中具有性别特异性作用的靶向lncRNA，LINC00473。它仅在抑郁症妇女的mPFC和其他几个前脑区域下调。病毒介导的LINC00473在小鼠mPFC神经元中的表达增加了两种慢性应激模型中的行为弹性。这种行为弹性与皮质醇水平降低、锥体神经元sEPSC频率和振幅降低以及慢性应激对基因表达的显著影响有关。研究人员发现由LINC00473调控的基因包括cAMP-CREB信号，cAMP-CREB信号是一种已知的在培养细胞中调控LINC00473的途径。当研究人员用forskolin诱导人源性神经母细胞瘤内源性LINC00473表达时，研究人员发现LINC00473主要与脑功能相关的基因结合，包括一些先前与抑郁和焦虑有关的基因。总之，这项研究提供了一个新的观点，即大脑中的分子适应以性别特异性的方式导致抑郁症，并可能导致为该综合征的性别特异性治疗确定新的靶点。研究人员认为lncRNA参与抑郁症发病机制，得到了最近两项全基因组相关研究（GWAS）的支持：许多lncRNA基因位点与抑郁症相关，lncRNA基因中的SNP与抑郁症风险单独相关。描述人类lncRNA的研究发现，抑郁症患者的rACC和血液存在差异。然而，这些先前的研究都没有解释受试者的性别，也没有提供lncRNA表达与性别特异性抑郁风险之间的机制联系。值得注意的是，在这些研究中，LINC00473没有被突出显示。考虑到LINC00473在性别上的特殊作用，这并不奇怪。鉴于lncRNA在抑郁症中的研究是一个新兴的领域，研究人员为进一步探索lncRNA靶点提供了重要的资源，也为探索特定的lncRNA候选及其在抑郁症中的性别特异性作用提供了多种实验方法的框架。研究人员的分析表明，在人类抑郁症中，lncRNA以一种特定大脑区域和性别的方式代表了很大一部分调控转录物。这种区域选择性与lncRNA的高度组织特异性表达模式一致。研究人员发现的一些影响可能是由于lncRNA表达水平的基线性别差异造成，但LINC00473的情况并非如此，其在大脑中的表达在基线水平上男女之间是相等的。在全基因组水平上，对lncRNA的性别调控知之甚少。研究最多的lncRNA之一，Xist，具有女性特异性，在X染色体失活中起着关键作用。因此，研究人员的发现支持了进一步研究lncRNA在大脑中的性别特异性调控的重要性。未来的研究应包括确定抗抑郁药物和酒精等精神药物的潜在影响，以及抑郁症严重程度和其他临床变量对lncRNA调控的影响。研究人员发现内源性LINC00473在rACC神经元的细胞核内富集（图2E）。这一发现与LncATLAS数据库以及在不同组织中进行的其他研究相吻合。核定位显示lncRNA参与核过程，如支架或转录调控。事实上，研究人员发现改变LINC00473的表达水平，无论是在小鼠mPFC神经元还是在人类NPC中，对基因表达都有很强的影响，在女性来源的细胞中可以看到更强的影响。有趣的是，与研究人员的FISH结果（图2E）相似，其他研究组也注意到LINC00473位于每个核的两个点状核结构内。研究人员的ChIRP结果表明LINC00473与自身的基因组位点结合，提示LINC00473存在一个潜在的自我调控反馈。通过病毒介导的基因传递，研究人员发现尽管LINC00473是灵长类特有的lncRNA，但其在mPFC神经元中的表达促进了应激恢复，尽管在雌性和雄性小鼠中达到了同等的表达水平，这种效应仅在雌性小鼠中可见。这种有助于恢复的行为效应被应用于两种慢性应激模型中，即CSDS和CVS。本研究中测量的各种行为结果表明，LINC00473可以减少压力应激引起的抑郁和焦虑样行为。这很有趣，因为人类女性比男性更容易患抑郁症和焦虑症。研究人员用6天的CVS来适应HSV表达的短时间。这种相对较短的应激足以引起一定的应激效应，正如研究人员报道的大理石掩埋和最新抑制喂养实验，但不足以影响强迫游泳或蔗糖偏好行为。研究人员还发现循环中的CORT水平存在基线性别差异，女性的CORT水平较高。在mPFC神经元中LINC00473的表达影响了雌性小鼠的循环CORT水平，这种影响在雄性小鼠中未见。总之，小鼠模型揭示了在mPFC中LINC00473表达的女性特异性效应，与mPFC中LINC00473的下调一致。雌性小鼠mPFC的RNA-seq实验表明，表达LINC00473的小鼠的行为应激恢复能力与慢性应激导致的基因表达改变显著减弱有关。受LINC00473影响的基因包括一个亚群，受CREB途径调控。此外，CREB信号在抑郁症中以特定大脑部位的方式被改变，这一点已经得到很好的证实。研究人员最近报道了mPFC神经元CREB的下调促进了两性的应激敏感性。这与研究人员在抑郁症妇女中发现的LINC00473表达降低，以及在雌性小鼠中表达LINC00473的促恢复作用是一致的。研究人员的ChIRP研究发现，经过forskolin治疗和随后的LINC00473诱导，LINC00473结合CREB-BP基因位点，提示LINC00473可能影响CREB的作用。总之，这些发现表明灵长类动物中产生的LINC00473介导CREB对其基因靶点的额外影响，并可能控制情绪，特别是雌性。充分了解LINC00473影响女性基因表达和下游结果（突触活动和行为）的分子基础将是非常重要的。需要进一步的研究来确定这些性别特异性作用是否反映了女性和男性LINC00473基因靶点上的不同染色质结构，或者控制LINC00473作用的其他分子（RNA或蛋白质）的性别特异性表达。总之，研究灵长类特有基因在精神疾病中的作用机制是一个挑战。为了解决这一问题，研究人员采用了多种方法，包括在成年小鼠mPFC神经元中表达灵长类特异性LINC00473，在人NPC中敲低该基因，以及在人源的培养细胞中控制内源性基因的表达。细胞培养研究使得在相关的基因组背景下检测内源性LINC00473的作用成为可能，而动物模型允许在应激模型中研究与抑郁症直接相关的基因。尽管这两种方法都对LINC00473促进弹性和女性特异性作用机制提供了深入了解，但LINC00473作用的分子基础可能还涉及其他灵长类特异性作用。研究人员的结果为其他研究灵长类特异性lncRNA如何影响复杂的大脑疾病提供了路线图，并为未来的研究提供了性别特异性lncRNA库。综上所述，这项研究表明，复杂的灵长类大脑使用lncRNA来促进包括情绪在内的大脑高级功能的调控，而这些过程的功能失调会以性别特异性的方式导致抑郁和焦虑等病理状态。
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