科研 | Cell新冠科研：多模型转录组学揭示SARS-CoV-2独特驱动特征
编译：思越，编辑：十九、江舜尧。
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SARS-CoV-2引起疾病的大流行，但关于SARS-CoV-2感染后的病毒行为和宿主反应的研究很少。作者通过深入分析SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒的转录应答情况。SARS-CoV-2感染的细胞和动物模型，以及COVID-19患者的转录和血清谱分析，发现SARS-CoV-2对宿主的转录反应具有独特的表征，且病毒复制与免疫表达存在不平衡关系，表现在I型和III型干扰低的表达、趋化因子升高以及IL-6的高表达。
论文ID
原名：Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19
译名：宿主对SARS-CoV-2的不平衡反应推动COVID-19的发展
期刊：Cell
IF：36.216
发表时间：2020年5月15日
通讯作者：Benjamin R. tenOevert
通讯作者单位：西奈山医学院
DOI号：10.1016/j.cell.2020.04.026
研究背景
冠状病毒是具有多宿主单股正链RNA病毒。在过去20年，人畜共患病事件中出现了3种高致病性的人类β冠状病毒（SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2）。目前，世界正遭受由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎（COVID-19）大流行，感染的患者通常会有发烧，咳嗽和全身不适的一系列症状，更严重者会发展为急性呼吸窘迫综合征和急性肺损伤甚至死亡。
宿主对病毒感染的生理反应通常是在病毒复制后的细胞水平上启动的。在病毒进入后，被感染细胞通过使用多种模式识别受体（PRR）家族中的任何一种来检测病毒复制的存在，进而形成的异常RNA结构。这些结构的参与最终导致受体的低聚化和下游转录因子的激活，最显著的是干扰素调节因子（IRF）和核因子κB（NFκB），而IRF和NF-κB的转录激活会导致两种抗病毒程序的启动，分别是通过I型和III型干扰素（分别为IFN-I和IFN-III）的转录诱导及随后的干扰素刺激基因（ISG）的上调介导的细胞抗病毒防御，以及通过趋化因子分泌介导的白细胞特定亚群的招募和协调。这种广泛存在的抗病毒程序使得病毒不断演变以适应选择性压力，使宿主对病毒的反应不同，并会造成不同程度的发病和死亡率。SARS-CoV和甲型流感病毒（IAV）均编码多种不同的拮抗剂来应对IFN-I/-III反应。SARS-CoV对IFN的拮抗作用主要由ORF3B、ORF6和核衣壳蛋白（N）等基因编码产物引起并编码核酸酶nsp1，参与切割宿主mRNA以防止核糖体装载并导致宿主细胞关闭。IAV编码的非结构蛋白1（NS1）也是IFN-I/I/III拮抗剂，它通过结合和掩蔽感染过程中产生的异常RNA来阻断模式识别受体（PRR）的初始检测。
为了更好地了解SARS-CoV-2的分子基础，本文在体外组织培养，原代细胞的体外感染以及源自COVID-19患者和动物等模型系统中表征其对感染的转录反应，并对比其与呼吸道病毒SARS-CoV和甲型流感病毒（IAV）的差异。
结果
1.表征SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒的转录反应
作者首先观察了各种呼吸道细胞系中的病毒感染情况。从受感染的细胞中收集了poly（A）RNA，并进行了RNA测序（RNA-seq）以估算病毒载量。这些数据表明SARS-CoV-2病毒感染水平占总RNA读数的0.1％至50％以上（图1A），且A549肺泡细胞对于SARS-CoV-2的病毒复制载量较低。随着病毒载量的增加（MOI=2），并未观察到刺激干扰素IFN-I和IFN-III表达的TBK1、STAT1和MX1的表达增加（补充图1A）。用载体在A549细胞中表达mCherry、ACE2（图1B-1D）。在低MOI感染（MOI=0.2，*表示）中，ACE2的外源表达使SARS-CoV-2能够复制并占总读数的约54％（图1A和1B，淡红色线*），并增加了N蛋白的表达（图1C），且E基因和nsp14基因的表达相比之前高出103（图1D）。使用增加10倍的病毒量（MOI=2，深红色线），IFN-I和IFN-III表达恢复，且SARS-CoV-2的病毒读数和低MOI相近。
接着作者用IFNβ处理细胞，发现添加IFN-I导致病毒RNA和蛋白质水平显著减少（补充图1B和C）。加入蛋白激酶JAK1和JAK2抑制剂鲁索替尼，阻断IFN-I信号传导时，抑制了ISG水平，但S蛋白的水平未增加（补充图1D-H）。此外，鲁索替尼治疗后，对细胞因子和趋化因子的影响较小，说明SARS-CoV-2感染中这些基因的高诱导作用独立于IFN-I和-III信号传导（补充图1G）。
为了确定体外感染如何改变宿主转录环境，作者通过比较不同病毒与对照组间的差异基因表达情况，发现SARS-CoV-2的转录反应与所有病毒的转录反应显着不同（图1E）。且A549经过ACE2修饰相比之前，其转录水平也明显不同（图1A和1E，圆形与正方形）。对于不同MOI的A549-ACE2细胞，IFN-I或IFN-III表达不显著，但显示中等水平的ISG子集和独特的促炎细胞因子信号（图1F）。病毒复制水平与IFN产生/信号转导之间的差异表明，尽管SARS-CoV-2能够与IFN-I和IFN-III结合，但通过在高MOI条件下拮抗来阻止。
图1 肺上皮宿主细胞对SARS-CoV-2和其他人类呼吸道病毒的反应
补充图1 SARS-CoV-2感染中干扰素（IFN）的应答
2.原代细胞中SARS-CoV-2引起有限的IFN-I和III反应
接下来为了确定正常人支气管上皮（NHBE）细胞对SARS-CoV-2感染的反应，将细胞分为SARS-CoV-2、单独使用IFN-I、感染野生型（WT）IAV、缺乏抗病毒拮抗剂（IAVΔNS1）的突变型IAV。在IFN-I处理和IAVΔNS1中，共发现381个显著基因可能与先天免疫应答有关，SARS-CoV-2和WT IAV 只有8个共有显着诱导的基因，包括白介素6（IL-6），IRF9，ICAM1和肿瘤坏死因子（TNF）（图2A;补充图2A）。PCA分析显示，沿主要成分一占样本变化的60％以上，且SARS-CoV-2引起最多的转录改变（图2B）。基因富集分析表明，SARS-CoV-2和IAV的IFN-I信号传导减弱（图2C和2D），而IAVΔNS1细胞会引起IFNB和IFNL1-3表达增加，说明减弱的抗病毒反应是由NS1表达介导。NHBE细胞中还引起趋化和炎症反应，以及对IFN-II等特殊信号途径（图2C，2D和S2B）。
图2 宿主在人支气管上皮细胞中对IAV和SARS-CoV-2的转录反应
补充图2 NHBE细胞中SARS-CoV-2感染性和宿主反应
3.动物研究揭示对SARS-CoV-2的体外反应失衡
作者选择雪貂进行了动物体内纵向研究。雪貂在鼻内感染SARS-CoV-2或IAV，并通过洗鼻进行监测。通过对呼吸道的细胞的不同时间点进行RNA-seq，从而量化随时间推移的病毒载量。感染1天后，读数显示病毒复制水平较低，占总读数的0.006％（图3A）。感染后三天，病毒复制在总测序读数的1.2％，达到峰值，然后在第7天降至0.05％，并在第14天完全消失（图3A），而在IAV感染雪貂第7天时，总读数已降至不到0.03％（补充图3A）。
接着作者比较转录差异随时间的变化，通过与对照组比较发现，感染后第1天，病毒检测量相关的转录差异非常小（图3B）；到第3天，以CCL8和CXCL9标记的细胞因子开始显著的。到第7天，尽管病毒水平下降，但CCL2，CCL8和CXCL9等细胞因子仍然显著（图3B）。此外，CD163，CD226，CCR5，CCR6，CXCR1，CXCR2和CXCR7在第7天显著上调（图3C），但强度明显低于IAV（补充图3B）。到第14天时，没有检测到SARS-CoV-2的病毒读数，细胞因子恢复了基线，但IL-6和IL1RN或IL1RA仍然升高（图3B和3C）。通过差异表达基因的富集分析，涉及两个免疫细胞特征群（图3D）。第一类包括单核细胞和淋巴细胞的标记物，并在SARS-CoV-2和IAV之间表达接近（图3D和补充图3C）。第二类为SARS-CoV-2的特有基因标记，与造血细胞系的祖细胞相关，提示感染可能正在诱导造血作用（图3D和补充图3C）。
图3.雪貂对SARS-CoV-2宿主反应的纵向分析
补充图3.雪貂对SARS-CoV-2和IAV的转录反应
4.COVID-19患者表现出低IFN-I和-III以及高趋化因子特征
作者比较了60岁以上的男性的COVID-19阳性患者的肺部样本与未感染个体的活检健康肺组织差异。转录组分析显示，约2,000种差异表达的基因具有丰富的先天和体液反应（图4A和补充图4A），通过半定量PCR检测到并未检测到IFN-I或IFN-III（补充图4B）。除了与先天抗病毒免疫有关的基因外，SARS-CoV-2还诱导了强大的趋化因子水平，包括CCL2，CCL8和CCL11（图4A）。这些数据与作者在NHBE和雪貂模型中的发现一致（补充图4A）。
接着作者希望从血样中检测由SARS-CoV-2感染诱导的循环细胞因子。于是从经鼻咽拭子检测为SARS-CoV-2阳性，或因非COVID-19相关的呼吸系统疾病入院（每组n = 24）的两个队列中获得血清，检测发现IFNβ和IFNλ的含量没有差异（图4B）。对血清样品中定量的细胞因子和趋化因子进行分析显示，COVID-19患者的全身炎症反应增强，表现在循环IL-6，IL1RA，CCL2，CCL8，CXCL2，CXCL8，CXCL9和CXCL16水平增高（图4C）。CXCL9和CXCL16分别是T细胞或自然杀伤（NK）细胞的化学引诱剂，CCL8和CCL2负责招募单核细胞和巨噬细胞，CXCL8是经典的嗜中性白细胞趋化因子，这些因子的显着升高提示可能是COVID-19患者中观察到的病理特征的驱动因素。
图4.临床COVID-19患者的转录和血清学特征
补充图4.不同模型的SARS-CoV-2感染之间涉及的生物过程
讨论
在这项研究中，作者在细胞系、原代细胞培养物、雪貂和COVID-19患者中研究了宿主对SARS-CoV-2和其他人类呼吸道病毒的反应。通过比较宿主对SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒感染的转录反应，以确定可能构成COVID-19生物学基础的转录特征。与其他高致病性冠状病毒以及IAV、人副流感病毒3型（HPIV3）和呼吸道合胞病毒（RSV）等常见的呼吸道病毒相比，宿主对SARS-CoV-2感染的整体转录印迹是不同的。
尽管存在病毒复制，但宿主对SARS-CoV-2的反应未能启动强劲的IFN-I/-III反应，同时诱导招募效应细胞所需的高水平趋化因子。鉴于免疫反应的减弱使得病毒复制得以持续，这些发现可能解释了为什么严重的COVID-19病例更经常在有合并症的个体中观察到。随着感染复数的升高，病毒可以在A549-ACE2细胞和CALU-3细胞复制活跃，并观察到IFN-I和IFN-III特征，在对A549-ACE2细胞的低MOI感染中，高水平的病毒复制在没有IFN-I/-III诱导的情况下也可实现。这些数据表明，在低MOI感染下，病毒不能强劲地诱导IFN-I/-III系统，但在高MOI感染下，这一点是可以实现的。这些动态也可能在感染过程中促进COVID-19产生。
通过多系统的观察，发现在细胞因子的大量产出后，随后才发生转录反应，例如单核细胞相关趋化因子（比如CCL2和CCL8）、以及中性粒细胞的诱导。在对SARS-CoV-2的反应中，两种独特升高的细胞因子是IL-6和IL1RA，这表明COVID-19和细胞因子释放综合征（CRS）之间可能存在平行关系，其中CRS是CAR-T细胞治疗后常见的一种并发症。如果情况属实，那么托珠单抗（tocilizumab）和阿那白滞素（anakinra）等药物可能会被证明对治疗COVID-19有利。未来的研究将需要正式解决这个问题。
通过研究发现，SARS-CoV-2倾向于选择性地诱导老年人群的发病率和死亡率。这种发病率的生理学基础被认为是Ⅱ型肺细胞的选择性死亡，从而导致空气交换功能丧失和肺部液体渗漏，有可能解释了在免疫系统健康、免疫力强的年轻人中，这种病毒感染通常是无症状的。
综上所述，在控制病毒复制与适应性免疫应答的激活方面，SARS-CoV-2的应答是不平衡的。鉴于这种动态，COVID-19的治疗与IFN反应的关系较小，而更多与控制炎症有关。COVID-19患者中许多趋化因子和IL升高，因此在未来的工作应集中FDA批准的可快速部署并具有免疫调节特性的药物上。
评论
本文通过将SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒的转录反应进行比较，以确定可能构成COVID-19生物学基础的转录特征。这些数据证明对SARS-CoV-2的总体转录是独特的。尽管存在病毒复制，但宿主对SARS-CoV-2的反应未能启动强大的IFN-I和-III应答，同时诱导了募集效应细胞所需的高水平趋化因子。由于减弱的免疫反应将使病毒持续复制，并可能解释了在合并症患者中更经常观察到严重的COVID-19病例的原因。
图5 SARS-CoV-2复制与免疫表达存在不平衡关系
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