科研 | EMERG MICROBES INFEC：新型冠状病毒患者支气管肺泡灌洗液和外周血单个核细胞的转录组学特征（国人佳作）
编译：逍遥君，编辑：景行、江舜尧。
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正在进行的COVID-19疫情在世界范围内造成了毁灭性的死亡，对公共卫生构成了巨大的威胁。然而，由于科学界对这种致死性疾病的宿主免疫应答的了解有限，阻碍了有效治疗药物的确定和治疗。因而本研究为了鉴定SARS-CoV-2（HCoV-19）感染后宿主炎症反应的转录特征，对从COVID-19患者支气管肺泡灌洗液（BALF）和外周血单核细胞（PBMC）标本中分离的RNA进行了转录组测序。结果揭示了患者SARS-CoV-2感染的不同宿主炎性细胞因子谱，并强调了COVID-19发病机制与过度细胞因子释放如CCL2/MCP-1、CXCL10/IP-10、CCL3/MIP-1A和CCL4/MIP1B之间的相关性。此外，SARS-CoV-2诱导的淋巴细胞凋亡和P53信号通路的激活可能是患者淋巴细胞减少的原因。COVID-19患者的转录组数据集将是临床指导抗炎药物和了解宿主反应分子机制的宝贵资源。
论文ID
原名：Transcriptomic characteristics of bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood mononuclear cells in COVID-19 patients
译名：新型冠状病毒患者支气管肺泡灌洗液和外周血单个核细胞的转录组学特征
期刊：Emerging Microbes & Infections
IF：5.776
发表时间：2020年3月
通讯作者：周宇&蓝柯&陈宇
通讯作者单位：武汉大学生命科学学院现代病毒学研究中心病毒学国家重点实验室
DOI号：10.1080/22221751.2020.1747363
实验设计
结果
为了研究SARS-CoV-2感染对患者的影响和机制，研究者利用RNA-seq检测了健康和COVID-19（2019冠状病毒病）患者的PMBC（外周血单核细胞）和BALF（支气管肺泡灌洗液）样本中的转录组变化（图1A）。从武汉大学中南医院获得样本，包括2例患者（WHU01-2）的BALF样本，3例患者（P1-3）和3例健康人（N1-3）的血液样本。3份BALF健康样本（Ctrl1-3）的数据来自既往研究。利用Ficoll密度梯度离心法分离血液中的PBMC，然后进行RNA文库构建和高通量测序。RNA-seq数据质量控制分析后，BALF患者样本含有高比例的病毒读段，而健康对照数据集计数为零。但来自患者的PBMC样本几乎不含病毒读取，表明SARS-CoV-2可能不会感染PBMC。
对于BALF样本，共检测到9609个表达基因，其中与健康个体相比，患者679个基因上调，325个基因下调（图1B）。对于PBMC样本（图1C），发现了更多表达信号的基因（15726），其中707个基因显著上调，316个基因下调。其中，虽然无显著的统计学差异，但3例患者中有2例IL6和IL6R降低（图1D、E），而TP53表达呈增加趋势（图1F）。总之，该数据为研究SARS-CoV-2感染后的RNA调控提供了一个整体和定量的资源。
图1. COVID-19患者BALF和PBMC中基因表达的全基因组分析。（A）实验设计：制备患者或对照者PBMC和BALF，提取总RNA，通过RNA-seq进行分析，鉴定与COVID-19疾病发病机制有关的差异表达基因。（B，C）与对照组相比，COVID-19患者BALF（B，WHU01-2 vs. Ctrl1-3）和PBMC（C，P1-3 vs N1-3）中基因的热图分别显著上调和下调。（D-F）PBMC患者（P1、P2、P3）和健康对照（N1、N2、N3）中RNA-seq信号分别为3个基因：IL6（D）、IL6R（E）和TP53（F）的表达差异。
2 调控基因的功能富集分析
对BALF和PBMC中的差异调控基因进行基因功能富集分析，以监测患者和健康人细胞的变化。对于BALF样本，上调的基因与病毒的侵袭有关（图2A）。最富集的生物学过程是“靶向膜的共翻译蛋白”、“靶向ER的蛋白”和“病毒转录”；而PBMC中上调的基因主要富集在“补体激活”、“循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答”和“B细胞介导的免疫”中（图2B），表明PMBC中存在活化的免疫活性。
图2. COVID-19患者BALF和PBMC中上调表达基因的GO-term和KEGG通路富集。（A）对COVID-19患者BALF中上调基因进行3类（BP、MF、CC）GO-term功能富集和KEGG通路分析。（B）COVID-19患者PBMC中上调基因GO-term功能富集和KEGG通路分析。
患者BALF中下调的基因富集在“免疫细胞活化”的生物学过程中（图3A）。相反，患者PBMC中下调的基因参与了“轴突导向”、“神经元投射导向”和“mRNA相关生物学过程”等其他生物学过程（图3B）。
此外，对这些上调和下调的基因进行KEGG通路分析。在BALF样本中，富集改变基因途径包括“核糖体”、“内质网中的蛋白质加工”、“吞噬体”、“戊糖磷酸途径”、“碳代谢”和“溶酶体”（图2A和图3A）。PBMC样本，“细胞周期”和“代谢”通路富集上调基因，而细胞因子相关通路富集下调基因，如“病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用”、“NF-κB信号通路”、“Toll样受体信号通路”、“IL-17信号通路”（图2B和图3B）。
图3. COVID-19患者BALF和PBMC中下调表达基因的GO-term和KEGG通路富集。（A）对COVID-19患者BALF中下调基因进行3类（BP、MF、CC）GO-term功能富集和KEGG通路分析。（B）COVID-19患者PBMC中下调基因GO-term功能富集和KEGG通路分析。
3 调节细胞因子分析
根据以前的临床报告，COVID-19患者有细胞因子风暴，鉴定了BALF（图4A）和PBMC（图4B）中所有表达的细胞因子，显著变化的基因用星号标记。与临床病例一样，BALF中可见细胞因子高表达。与实验室结果一致，发现细胞因子IL10、CCL2/MCP-1、CXCL10/IP-10、CCL3/MIP-1A和CCL4/MIP1B在患者BALF样本中高表达。两例患者之间的进一步比较表明，一些细胞因子的表达，如IL10、IL36RN、IL36G、TNFSF15、CCL5、TNFSF10、CXCL1和IL33，在患者之间是可变的。
图4. COVID-19患者炎性细胞因子表达。与对照组相比，描述COVID-19患者BALF（A，WHU01-02 vs. Ctrl1-3）和PBMC（B，P1-3 vs. N1-3）中炎性细胞因子基因表达的热图。显著上调和下调的基因用星号标记。
4 SARS-CoV-2感染可能引起淋巴细胞凋亡
此前对3例患者的实验室检查结果表明患者血液中各种类型免疫细胞（包括淋巴细胞）的细胞计数减少。既往的临床和尸检报告表明，患者的淋巴细胞已经大大减少。本研究发现几个显著改变的基因富集到细胞凋亡和P53信号通路（图5），包括CTSL、CTSB、DDIT4、RRAS、CTSD、BIRC5、TNFSF10、CTSZ、NTRK1、IGFBP3、CCNB1、RRM2、CCNB2、GTSE1、CDK1、STEAP3和TP53I3。细胞凋亡过程中的重要基因TP53在2例患者中表现出增加的趋势，表明PMBCs减少可能是由于细胞凋亡。
图5. PBMC中的凋亡相关通路。heatmaps显示了不同信号通路中差异表达基因的表达水平，包括（A）自噬信号通路，（B）凋亡信号通路，（C）p53信号通路。显著上调和下调的基因用星号标记。
5 比较患者BALF和PBMC中不同变化的基因
该病毒似乎不感染PBMC，因为未能在PBMC中检测到病毒RNA以及ACE2的表达。为了说明两种细胞类型之间的差异，对BALF样本和PBMC之间具有不同趋势的基因进行了分类（图6A、B）。有17个基因向同一方向变化，而36个基因趋势相反。
首先分析了PBMC中增加但BLAF中减少的基因。在15个基因中，有5个基因参与小分子分解代谢过程：ADA2、HK1、MGAT1、PGD和PLA2G15。并且4个基因参与中性粒细胞活化和免疫：ADA2、CTSD、GAA、LAIR1。接下来，分析了BLAF中增加但PBMC中减少的基因，虽然，两个样本之间有17个基因以相同的趋势变化，但生物学意义仍需进一步研究（图6B）。
图6. BALF和PBMC中差异表达基因的比较。（A）显示BALF和PBMC样本之间趋势相同或不同的变化基因数量的维恩图。（B）热图描绘BALF和PBMC样本之间相同或不同趋势的基因表达变化。
结论
SARS-CoV-2感染可引起严重的肺部疾病和并发症，并具有显著的发病率和死亡率。目前，这种致死性肺部疾病还没有最佳的治疗方法或有效的药物。由于对宿主对其免疫反应的理解有限，使得很难设计新型治疗药物。本研究使用一些患者和健康人的BALF和PBMC样本，进行了全基因组RNA测序来表征COVID-19患者的宿主免疫反应。发现，将COVID-19患者的BALF和PBMC样本分别与对照组进行比较时，1004和1023个基因存在差异表达。这些基因分为体液免疫反应、淋巴细胞介导的免疫和补体激活等类别，它们都在限制病毒感染中发挥重要作用。还发现与对照组相比，COVID-19患者BALF样本中大量细胞因子的表达显著升高。这些数据表明SARS-CoV-2病毒感染导致细胞因子风暴，这与疾病严重程度相关。还观察到各自趋化因子受体的转录增加，表明这些炎症信号被激活。在大部分SARS和COVID-19患者中发现了淋巴细胞减少，但其潜在机制仍不清楚在患者PBMC中未观察到任何病毒基因表达，表明SARS-CoV-2病毒可能不会感染COVID-19患者的淋巴细胞。总体而言，SARS和COVID-19患者中的淋巴细胞减少更可能是由内源性或外源性糖皮质激素引起的，其最终导致淋巴细胞凋亡，而不是这些细胞的直接病毒感染。
总之，本研究表明SARS-CoV-2病毒感染刺激独特的特征表明过度的促炎细胞因子释放可能是COVID-19患者的标志。此外，COVID-19患者BALF和PBMC RNA-seq数据集为进一步彻底分析提供了有用的资源。
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