这些外泌体分离方法你都知道吗？ | 外泌体

外泌体是胞内体逆出芽形成多囊泡胞内体，多囊泡胞内体与细胞膜融合，向细胞外释放形成外泌体。几乎所有的细胞都可以分泌外泌体（直径30~100 nm），其存在于大多数种类的细胞和多种体液当中，同时也存在于大多数种类细胞的培养液中。

外泌体中包含多种成分，如蛋白质、脂质、RNA，其中RNA种类有：mRNA、miRNA及其他非编码RNA。

近年来，关于外泌体的研究十分热门，今天小编就来给大家普及一下外泌体研究中的第一步：如何高效分离外泌体？

1试剂盒提取

近年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，如SBI外泌体试剂盒，Thermo Fisher的Total Exosome Isolation试剂盒等，可快速便捷地从血液样本中获得高质量外泌体。这些试剂盒不需要特殊设备，提取效率和纯化效果高，受到越来越多研究者的青睐。

小编专门请教了实验室做外泌体实验的老司机。老司机推荐了加拿大Norgen公司的外泌体分离与RNA提取试剂盒。这款试剂盒除了具备操作简单的特点外，能快速纯化富集到与超速离心法一样高质量的外泌体。这款试剂盒的性能，大家看下面四张图就能一探虚实。

2超速离心法

超速离心法是目前最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将大小相同的囊泡从样本中沉淀并纯化出来。外泌体超速离心一般和蔗糖密度梯度离心或蔗糖衬垫组合起来分离低丰度外泌体。需在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀（含有外泌体）120分钟，使样品中的外泌体在1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。

尽管这种联合的方法可以获得高度纯化的外泌体，但也存在一些缺点。例如同批次最多只能同时处理6个样本（转子限制）且回收率不稳定，前期需要准备大量材料且外泌体得率低。最重要的是重复离心很可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，并且一些可溶性蛋白可与外泌体形成团块而产生污染。

3超滤离心法

超滤离心法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。

这种方法比较简单高效，也不影响外泌体的生物活性，但缺点是外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。

Tips：外泌体是直径30~100 nm囊状小体，大于一般蛋白质。采用此方法需要考虑到与外泌体大小相似的其他囊泡的干扰。

4磁珠免疫法

外泌体表面有其特异性标记物（如CD9，CD81，CD63，CD82，Hsp70，Ras相关蛋白Rab-5b，细胞骨架蛋白肌动蛋白和TSG101等），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。因为外泌体的异质性与它们的起源一致，不同外泌体上的标记物丰度也不同，通过特定的抗体组合可以从样本中捕获不同类型的外泌体，进行选择性分离。

磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

5PEG-base沉淀法

聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早期应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。在4℃利用PEG孵育后通过过滤或离心即可沉淀、回收外泌体。

采用此种分离方法也存在不少问题：纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。

6其他方法（近期文献报道）

①交流电动（alternating current electrokinetic，ACE）微阵列芯片装置：简称ACE芯片，该芯片的单个电极的侧视图和俯视图如下所示，一个设备中有超过1000个电极，其表面涂覆薄薄一层多孔水凝胶，图中虚线所示DEP高场区即外泌体被富集的位置。在芯片电极处被富集的外泌体可直接用扫描电子显微镜（SEM）和免疫荧光等方法进行分析与鉴定。

该装置可以从未稀释的人血浆样品中快速分离获取外泌体，需要的样品量小，在15分钟内将外泌体集中到微电极周围的高场区域。洗涤去除大量血浆物质后，使外泌体浓缩在微电极上。分离、洗涤及芯片荧光分析步骤在30分钟内就可以完成。

参考文献：

Ibsen SD, Wright J, Lewis JM, et al. Rapid Isolation and Detection of Exosomes and Associated Biomarkers from Plasma[J]. ACS nano, 2017.

②基于新型声波流体技术（acoustofluidic technology）开发的声波筛选装置：细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成。两个声换能器生产的声波相互接触所形成的驻波会生成一系列压力节点。当细胞或粒子流过通道并遇到一个节点时，压力会引导细胞稍微偏离中心，细胞位移的距离取决于细胞大小和可压缩性等其他性质。

为了分离外泌体，研究人员将2个上述装置串联。第一个装置用来去除血液样本中的细胞和血小板，第二个装置的声波频率较高，可以把剩余血液样本中的更小的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来。利用这种装置完成100ml稀释血液样本的筛选工作用时不到25分钟。

参考文献：

Wu M, Ouyang Y, Wang Z, et al. Isolation of exosomes from whole blood by integrating acoustics and microfluidics.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(40):201709210.

注意事项

①分离exosome 前的样品不能加入任何RNA保护剂（如Trizol，RNA later）；

②分离好的外泌体如需进行粒径检测或流式鉴定，需放4℃保存，并尽快进行实验；

③不同样品来源富集到的外泌体含量相差较大，提取RNA总量也相差很大。相对来说，血清、血浆外泌体样品中外泌体含量较高。

外泌体提取相关方法汇总如上，在开展实验时可根据实际情况进行选择哦！

外泌体研究首选芯片的优势小编已在上期中详细阐述，可点此查看详细内容：

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