蛋白绝对定量技术及翻译后修饰分析介绍 | 蛋白质组专题

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。运用蛋白质组学技术可以大规模研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

本期专题将围绕蛋白质组学技术简介及应用场景展开，主要介绍蛋白相对定量技术、绝对定量技术以及蛋白修饰分析的原理及技术优势，蛋白组学常见研究模式，蛋白样本准备注意事项以及经典案例解读等。

今天内容主要为蛋白绝对定量技术及翻译后修饰分析介绍。一起来学习吧。

1蛋白绝对定量技术

质谱多反应监测技术/选择反应监测（mrm/srm）是对复杂混合物中目标蛋白质进行定量（absolute quantitation/ relative quantitation）的重要技术手段。通过mrm/srm技术进行实时的定量监测可以进行药代动力学研究、临床诊断、食品化妆品等工业质量控制、环境检测、农业植物学研究以及代谢组学和基于蛋白质组学的生物标志物发现、蛋白质翻译后修饰等相关研究。

mrm/srm技术的优势有：①质谱定量方法的金标准，被称为“基于质谱的ELISA”; ② 目前基于质谱重现性最好的技术通量高，一次实验可以平行定量几十到几百个蛋白；③重复性高，可以实现四个数量级的定量，变异小；④不需要抗体，因此适用于验证及定量因缺少抗体而无法采用Werstern或者ELISA进行定量的蛋白。

MRM实验流程

该方法首先检测到具有特异性的肽段，然后只将选定的特异子肽段进行质谱信号的采集。最终，通过合成同位素形成的目标肽段，将已知浓度的内标肽与待测样品混合，选择特定母子离子对获得不同的色谱检出信号，比较两者的信号强度值，实现目的蛋白质的绝对定量。

2蛋白修饰后分析

生物体中许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相关丰度控制，还会被各种时空特意分布、可逆的翻译后修饰调控，因此揭示翻译后修饰的发生规律是解析蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。

蛋白质发生翻译后修饰时其分子质量会发生相应的改变，通过质谱能够精确测定蛋白质或多肽的分子质量。同时，发生翻译后修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广，所以在质谱检测前需要对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集。

蛋白修饰分析

注意：①含非极性、疏水性R基的氨基酸：甘氨酸（Gly），丙氨酸（Ala），缬氨酸（Val），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile），脯氨酸（Pro），苯丙氨酸（Phe），色氨酸（Trp），蛋氨酸（Met）；②含极性、中性R基的氨基酸: 丝氨酸（Ser，）苏氨酸（Thr），半胱氨酸（Cys），， 酪氨酸（Tyr）天冬酰胺（Asn），谷氨酰胺（Gln）；③含酸性R基的氨基酸：天冬氨酸（Asp，）谷氨酸（Glu）；④含碱性R基的氨基酸： 赖氨酸（Lys），精氨酸（Arg），组氨酸（His）。

磷酸化分析流程

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