Mol Cell：mRNA的选择性翻译受RNA甲基化(m6A)调控 | 翻译组
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文章信息
论文标题：N6-Methyladenosine Guides mRNA Alternative Translation during Integrated Stress Response
发表日期：2018年02月
发表杂志：Molecular Cell
影响因子：14.248
研究机构：康奈尔大学等
研究技术：Ribo-Seq，QTI-Seq，m6A-seq，SILAC，RNA-Seq等
亮点发现
* ATF4重新翻译起始需要m6A去甲基酶ALKBH5参与
* ATF4重新翻译起始对mRNA的m6A水平敏感
* 全局的选择性翻译受5’UTR的m6A水平调控
* 肝脏特异的FTO转基因小鼠的翻译起始因m6A水平改变而发生变化
文章摘要
转录激活子4（Activating Transcription Factor 4，ATF4）是一种普遍的胁迫反应响应基因，同时也是综合应激反应（Integrated Stress Response，ISR）途径中的重要响应器，在由缺氧、氨基酸缺乏、氧化应激和内质网应激等应激信号诱导的反应中发挥重要作用。ISR通过eIF2α（一种真核起始因子）来促进细胞适应应激条件。在ISR中，应激相关mRNA的选择性翻译通常依赖于选择性机制，比如遗漏扫描（Leaky scanning）或重新翻译起始（Reinitiation），但其潜在机制仍不完全清楚。本文发现，为应答氨基酸饥饿，ATF4的重新翻译起始不仅受eIF2α信号通路控制，而且还受到RNA甲基化（m6A）的调控。在敲除去甲基化酶ALKBH5，ATF4重新翻译起始被抑制时，敲低m6A甲基转移酶（METTL3或METTL14）会促进ATF4翻译。进一步实验证实是5’UTR的m6A控制核糖体扫描和随后发生的起始密码子选择。起始核糖体的全谱分析揭示动态的mRNA甲基化水平会引起广泛的选择性翻译事件。与此一致的是，Fto（另一种去甲基化酶）转基因小鼠表现出增强的ATF4表达，再次突显m6A在ISR翻译调控中的关键作用。
研究发现
ATF4翻译不只受到eIF2α磷酸化调控
图1 饥饿诱导的ATF4重新翻译起始伴有uORF2的持续翻译
ATF4的成熟转录本在5’UTR中含有两个uORF：一个靠近5’末端（uORF1），另一个与CDS重叠（uORF2），但在不同的阅读框中（图1A上方）。核糖体会以Leaky scanning的方式通过uORF1（因其较短）迁移到uORF2。在正常生长条件下，uORF2的起始密码子处容易发生重新翻译起始，从而抑制ATF4翻译。既有观点认为，在ISR时，由于eIF2α磷酸化导致可用的三元配合物（TC）较少，迁移的核糖体扫描通过uORF2并开始翻译下游CDS。即认为ATF4合成上调是uORF2翻译减少的直接结果。作者采用QTI-seq（定量翻译起始测序）和Ribo-seq对此判断进行了实验验证。在营养丰富的条件下，QTI-seq显示uORF1和uORF2上有清晰的TIS（Translation Initiation Site）峰，但在ATF4的CDS上没有（图1A左）。正如预期的那样，采用Ribo-seq在CDS上只显示处于背景水平的核糖体密度，而在uORF2上显示出相当多的印迹。而在氨基酸饥饿处理时，CDS中出现大量印迹，这与ATF4 的翻译上调是一致的（图1A中）。令人惊讶的是，uORF2也表现出增加的read密度，但与uORF2相关的上游TIS(uTIS)峰却减少了。这种不一致的现象也出现在HEK293细胞中。
由于uORF2与ATF4的CDS重叠，氨基酸饥饿时增加的uORF2 read密度可能被高估了。通过构建萤火虫荧光素酶 (Fluc) 报告基因实验，直接检测有或无氨基酸饥饿的细胞中重叠 的ORF的翻译状态（图1B）。与内源性ATF4类似，氨基酸饥饿触发了ATF4-Fluc的翻译。而uORF2-Fluc的翻译在这些饥饿细胞中没有显示出任何相应的减少。因此，饥饿诱导的 ATF4合成似乎不是uORF2翻译减少的直接后果。ATF4的重新翻译起始很可能依赖于比以前认为的更复杂的机制。
ATF4重新翻译起始需要80S核糖体和ALKBH5
图 2 ATF4翻译的定量蛋白质组分析
为探讨体内ATF4重新翻译起始的模式，作者采用SILAC蛋白质组定量技术，测量了氨基酸饥饿前后与ATF4 mRNA结合的核糖体亚基的相对比例（图2A、B）。实验结果支持 ATF4重新翻译起始需要终止后的80S核糖体。
SILAC数据还揭示出许多与ATF4 mRNA关联的RBP蛋白（图2C）。令人意外的是，观察到ALKBH5量的增加，这是众所周知的m6A去甲基化酶。接着用免疫印迹实验证实了ALKBH5与ATF4 mRNA的关联性（图2D）。为解释ALKBH5是直接与ATF4 mRNA结合还是通过蛋白复合物形成间接结合，又用4-硫代尿苷(s4U)标记的 RNA与细胞内源蛋白进行零距离交联，证实ATF4 mRNA可以将ALKBH5拉下来（图2E）。这表明mRNA的m6A修饰在饥饿诱导的ATF4翻译中可能有潜在作用。
差异的mRNA甲基化会影响ATF4翻译
图3 mRNA甲基化影响ATF4翻译
为研究m6A去甲基化酶是否在ATF4翻译中发挥作用，作者使用慢病毒短发夹RNA（shRNA) 敲低MEF细胞中的ALKBH5。结果在氨基酸饥饿时，缺乏ALKBH5的细胞中ATF4合成显著减少（图3A）。此现象不符合既有的eIF2α信号通路调控的观点，因为敲低ALKBH5对eIF2α磷酸化几乎无影响。那是否去甲基化酶都会产生类似的影响，对另一个去甲基化酶FTO的敲低实验也得到了的一致的结果（图3B）。实验也证实ATF4 mRNA水平在敲低实验前后并没有显著变化，这表明ATF4表达降低发生在翻译水平。这些结果表明在ATF4翻译中去甲基化酶发挥积极的作用。
那么上述现象是由于去甲基化酶本身的结合还是随后的m6A修饰程度的改变，影响了ATF4的翻译？作者巧妙地使用shRNA沉默甲基转移酶复合物的核心亚基METTL3、METTL14，证明了m6A修饰程度下降会促进ATF4翻译（图3C、D）。而沉默MEF细胞中的甲基转移酶既不影响eIF2α信号通路，也不影响ATF4 mRNA的稳态水平。由此可说，饥饿诱导的ATF4翻译受到了mRNA上动态变化的m6A调控。
uORF2甲基化控制ATF4的翻译
图4 uORF2甲基化影响ATF4翻译
那到底是ATF4哪个位置的甲基化影响它的翻译？ATF4 mRNA具有较短的3’UTR，而它的5’UTR是带有调控性的uORF。为探究mRNA甲基化对ATF4翻译的影响，作者使用m6A-seq对有或没有氨基酸饥饿处理的MEF细胞进行了全局的甲基化分析。从ATF4的5’UTR到CDS出现多个m6A peak，但在3’UTR区没有（图4A）。有趣的是，在氨基酸饥饿处理时，只有uORF2（甲基化位点定位在A225）区域出现近3倍的m6A水平下降（图4B）。uORF2甲基化在敲低ALKBH5或 FTO的细胞中得到了恢复（图4C）。
为解释uORF2甲基化在ATF4翻译中的潜在作用，在Fluc reporter中引入了一个A225G突变，以阻止在该特定位点的m6A修饰。与野生型对照相比，A225G突变体在饥饿应答中表现出更高的Fluc水平（图4D），这与uORF2甲基化在ATF4翻译中的负作用是一致的。这些结果确立了在ISR期间uORF2甲基化对ATF4翻译的调控作用。
5’UTR甲基化控制起始密码子选择
图5 uORF2 甲基化起始密码子选择
uORF2甲基化是如何调控uORF2本身以及ATF4编码区的翻译？m6A修饰会对uORF2翻译施加了两种相反的作用：1）m6A位于uORF2内，可能作为核糖体延伸的路障；2）uORF2甲基化有利于uORF2翻译，可能是将扫描或迁移的核糖体定位在uORF2的起始密码子附近。不管怎样，这两种机制都会导致ATF4下游编码区的翻译受到抑制。m6A标记的检查点存在提供了一个故障保护机制，以阻止跳动的核糖体在营养丰富的条件下启动下游CDS的翻译（图5A）。作者用Toeprinting Assay和A225G突变体实验证实5’UTR甲基化起到了阻碍核糖体迁移的作用，从而增加了选择上游起始密码子的可能性，否则这些起始密码子将被跳过（图5B、C）。
5’UTR甲基化影响全局的选择性翻译
图6 m6A指导全局选择性翻译
考虑到5’UTR的动态甲基化变化对营养饥饿的响应，差异的m6A修饰可能是通过影响核糖体扫描过程来控制可变起始密码子的选择。作者采用m6A-seq分析营养缺乏前后细胞中的m6A谱。观察到5’UTR中甲基化普遍上升，而起始密码子后的m6A水平却相应下降（图6A）。为探讨起始密码子附近mRNA甲基化的变化是否与TIS选择相关，作者平行分析了QTI-seq和m6A-seq数据。对于没有uTIS密码子的转录本，聚类分析显示在注释的起始密码子 (aTIS) 周围核糖体密度和m6 A 水平存在协调变化；然而，对于携带多个TIS的转录本，aTIS密度和m6A水平变化之间的相关性较弱（图6B）。一个典型的例子，编码溶酶体加工蛋白COPB2的基因在营养饥饿时在aTIS下游的m6A明显下降（图 6C）。这些提示了一种以前未被重视的机制，m6a通过保留起始核糖体来控制翻译效率。
值得注意的是，许多5’UTR的uORF都是从非AUG起始密码子开始的，如CUG。作者推断5’UTR甲基化，通过保留扫描核糖体，可以促进在非最佳序列背景下选择非经典TIS。事实上，在QTI-seq捕获的所有uTIS中，大部分带有下游m6A修饰的uTIS密码子具有相对较高的TIS信号（图6D）。增加的5’UTR甲基化尤其增加非AUG密码子的信号。这些结果表明，m6A引导的选择性翻译在ISR期间具有更广泛的作用。
肝脏特异性Fto转基因小鼠存在选择性翻译
图7 肝脏特异性Fto转基因小鼠的选择性翻译
作者继续以肝脏特异性Fto转基因小鼠为模型，探究在mRNA甲基化的生理作用。采用m6A-seq检测肝脏裂解物中甲基化的情况。与MEF细胞相比，肝脏中5’UTR表现出更高的m6A水平（图7A）。固体组织中mRNA的翻译控制可能比培养细胞更容易受到mRNA 甲基化变化的影响。令人意外的是，即使在正常摄食条件下，FTO转基因小鼠肝裂解物也显示出比野生型更高的ATF4蛋白水平（图7B）。尽管Atf4 mRNA的基础水平略有升高，但Atf4蛋白水平的更多上升表明mRNA甲基化调节翻译在体内是成立的。这个结果得到了Ribo-seq实验的证实（图7C）。那FTO过表达和体内选择性翻译之间有怎样的关系？与 5’UTR甲基化促进uTIS选择的发现一致，相对于CDS，FTO过表达会导致5’UTR的核糖体密度降低（图7D）。为证实5’UTR甲基化的区域效应，作者根据5’UTR甲基化改变情况对转录本进行了分层。对于Fto转基因样品中5’UTR m6A水平下降的转录本，可以观察到5’UTR/CDS比率下降（图7E ）。这些结果表明5’UTR甲基化的动态变化不仅有利于 ATF4的选择性翻译，而且也有助于ISR期间全局的选择性翻译。
研究总结
氨基酸饥饿诱导的ATF4翻译受m6A甲基化调控。翻译起始的全局分析显示5’UTR的 m6A调控起始密码子选择，进而控制选择性翻译。
延伸阅读——m6A调控翻译的相关研究
1. Slobodin, B., Han, R., Calderone, V., Vrielink, J.A.F.O., Loayza-Puch, F., Elkon, R., and Agami, R. Transcription impacts the efficiency of mRNA translation via co-transcriptional N6-adenosine methylation. Cell 2017 169, 326–337.e12.
2. Zhou J, Rode KA, Qian SB. m6A: A novel hallmark of translation. Cell Cycle 2016 15(3):309-10.
3. Zhou J, Wan J, Gao, X, Zhang X, Jaffrey SR and Qian SB. Dynamic m6A mRNA methylation directs translational regulation of heat shock response. Nature 2015 526(7574):591-4.
4. Meyer KD, Patil DP, Zhou J, Zinoviev A, Skabkin MA, Elemento O, Pestova TV, Qian SB, Jaffrey SR. 5' UTR m6A Promotes Cap-Independent Translation. Cell 2015 163(4):999-1010.
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