Nat Commun：利用小RNA测序揭示植物抗病基因与miRNA以及phaisRNA之间的调控关系 | miRNA专题
植物经常受到各种病原体的攻击，从而进化出一系列防御机制，其中一个重要的机制是抗性基因（R基因）介导的抗病性，但其表达受到严格的调控。NBS_LRR基因是R基因最大的基因家族，miRNA靶向到一些NBS-LRR基因并触发这些转录本产生phasiRNA，phasiRNAs顺式或反式调节NBS-LRR基因，从而会造成R基因的表达抑制。
R基因会受到miRNA-phasiRNA的联合抑制，植物如何克服这种抑制以在防御期间诱导和维持R基因表达？R基因是否也影响了小RNA生成？深圳大学莫蓓莘课题组和加州大学河滨分校陈雪梅院士课题组联合在Nature Communications上发表了一篇题为“The disease resistance protein SNC1 represses the biogenesis of microRNAs and phased siRNAs”的论文。在该论文中，作者发现了在防御期间，R基因-miRNA-phasiRNA调控使R基因表达成为可能，从而实现放大植物免疫反应。
作者利用拟南芥pSUC2：amiR-SUL（amiR-SUL系统）进行EMS诱变筛选，以鉴定miRNA产生所需的基因。amiR-SUL系统的原理是：用维管束系统中特异表达的SUC2基因的启动子表达人工合成的miRNA，而该miRNA靶向叶绿素生物合成基因SUL,使其沉默，导致amiR-SUL系统植物的叶脉漂白（如图）。通过该体系，分离一个抑制突变体（amiR-SUL sup-B65），表现型为叶脉漂白减少，并有侏儒症和扭曲的叶片等表型，同时发现该突变体中的SUL mRNA和蛋白质的水平均增加，说明了该突变体的表型是由于amiR-SUL水平较低引起。作者进行了Northern印迹试验以检测内源miRNA，相对于amiR-SUL，amiR-SUL sup-B65中所有测试的miRNA（miR156，miR164，miR167，miR319和miR390）的水平降低。为了获得miRNA的整体变化水平，对amiR-SUL幼苗和amiRSUL sup-B65进行了小RNA测序。在amiR-SUL sup-B65中观察到miRNA积累整体减少，进一步表明内源miRNA含量在该突变体中降低，说明在该突变体中miRNA的生物发生是部分缺失。另一方面，通过重测序发现，该突变体其实是两个基因突变的组合产生的，分别为cpr1-4和aba1-8。
作者通过Northern印迹试验确定了cpr1 aba1突变体和野生型(Col)幼苗中miR159，miR164，miR319和miR394的表达水平，发现上述miRNA均在cpr1 aba1突变体中减少。接下来，为了证明CPR1和ABA1突变如何影响miRNA产生，对Col和cpr1 aba1突变体中11种pri-miRNA的水平进行RT-PCR检测，pri-miRNA的水平降低，并通过GUS染色验证，cpr1 aba1中miRNA的表达减少可能是由于MIR启动子活性受损，转录减少。
CPR1是F-Box蛋白，作为R蛋白SNC1的负调节因子，可能通过SCF（Skp1-cullin-F-box）介导的蛋白质降解。ABA1编码玉米黄质环氧酶，在ABA的生物合成的第一步中起作用。最近研究表明，ABA缺乏促进了SNC1的活性和核定位。因此，推测SNC1是amiR-SUL cpr1 aba1的amiR-SUL抑制表型的基础。作者将snc1突变体导入到amiR-SUL cpr1 aba1中后，发现snc1突变体完全拯救了amiR-SUL cpr1 aba1表型，并且表明CPR1和ABA1通过抑制SNC1表达促进amiR-SUL积累。将功能获得突变体snc1-1引入amiR-SUL背景中，相对于amiR-SUL，在amiR-SUL snc1-1中SNC1蛋白的丰度升高。amiR-SUL snc1-1植物比amiR-SUL植物小，并且叶子漂白显着减少。与amiR-SUL相比大量减少，在snc1-1aba1-8和amiRSUL snc1-1中，miRNA的含量和前体含量均减少，结果表明SNC1的过度积累和核定位通过抑制MIR基因的转录来降低miRNA的丰度。
为了验证核SNC1抑制miRNA生物发生的这一假设，作者试图通过β-雌二醇诱导型启动子在转录水平上诱导SNC1的核积累。SNC1-GFP和SNC1-NLS-GFP信号存在于细胞核和细胞质中，后者在细胞核中更富集。从这些植物中提取RNA并进行实时RT-PCR检测五种pri-miRNA（pri-miR159a，pri-miR159b，primiR164b，primiR166a和pri-miR167a）的表达水平降低，因此，SNC1的核积累抑制了一些miRNA的生物发生。
研究表明核SNC1通过与转录辅阻遏物TPR1的结合在防御反应中发挥作用。具有TPR1过表达的pTPR1：TPR1-HA植物的大小与cpr1 aba1植物相似。并且通过Northern印迹和RT-PCR试验，结果显示pTPR1：TPR1-HA中7种pri-miRNA的水平显着降低。这些结果表明，cpr1 aba1中SNC1的核积累与转录的辅阻遏物TPR1抑制MIR基因、下调miRNA的丰度的模型一致。
作者用Col和cpr1aba1进行了小RNA测序，以确定cpr1 aba1突变对phasiRNA产生的影响。来自7个TAS基因座中的4个的tasiRNA水平在cpr1 aba1中显着降低，其前体TAS转录物水平在cpr1 aba1中也降低。同时发现在cpr1 aba1中，来自三个NBS-LRR基因（At5g38850，At5g43740和At1g63750）的phasiRNA均降低。
RNA-seq结果显示与Col相比，cpr1/aba1中有70上调和4个下调的NBS-LRR基因，cpr1 aba1中广泛诱导NBS-LRR基因产生表明cpr1 aba1可能表现出对病原体抗性的增强。作者测试了cpr1-4和aba1-8植物对Pst DC3000和Pst DC3000（AvrRps4）两种菌株的抗性。ABA1中功能的丧失（或减少）导致细菌抗性增强。
该研究表明核SNC1通过与转录的辅阻遏物TPR1结合抑制MIR基因，从而抑制miRNA的产生。同时SNC1-TPR1还抑制来自三个R基因的phasiRNA的积累，并诱导R家族基因表达水平上调。因此这项工作揭示了SNC1可以通过抑制小RNA（miRNA、phasiRNA）的产生而解除对于R基因的表达抑制，从而实现植物主动防御，揭示了小RNA介导的植物防御的调控机制。
Qiang C, et al. The disease resistance protein SNC1 represses the biogenesis of microRNAs and phased siRNAs. Nature Communications (2018) 9:5080.
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