新发现：miRNA成熟体的甲基化修饰可作为癌症诊断的生物标志物？| miRNA甲基化助力胰腺癌早期筛查

经常关注“联川生物”公众号的读者一定会记得，我们在以往的刊文中有介绍到，miRNA的初始体结构（primary miRNA）的甲基化修饰（m6A）对于miRNA成熟体的加工至关重要^[1]，而且这种甲基化修饰信号也会直接关联到癌症的增殖、凋亡和转移^[2]。肯定会有学者提出疑问，以往研究关注的都是针对miRNA的初始体的m6A修饰，那么作为调控功能的直接参与者-miRNA成熟体，它的甲基化修饰又会有什么样的生物学价值呢？2019年8月发表在Nature子刊的一篇刊文给了答案。小编就给各位介绍这篇文献：

期刊：Nature Communications

影响因子：11.878

发表日期：2019年8月

研究背景Micro(mi)RNAs是一类高度保守的非编码RNA家族，其在体内可参与调控多种生物学进程。miRNAs具有高度的稳定性、组织特异性和易获得性，近年来在医学领域研究发现，肿瘤患者血液中的miRNA的种类和数量会发生变化，提示了肿瘤的发生与发展，miRNA可作为肿瘤早期的诊断标志物。以往的研究主要关注于miRNA的表达水平对于机体功能的影响，miRNA的分子修饰现象及作用很少有学者去研究。大量的证据表明，在胚胎发育，以及正常的生命进程中，包括编码蛋白的转录本和非编码转录本在内的大多数RNA分子，都是存在化学分子的修饰。有研究报道tRNA（转运RNA）存在多种化学基团的修饰，由于tRNA在长度和结构上与miRNA的前体十分相似，本文作者通过类比推理和假设猜想，成熟的miRNA是否也存在特异的化学基团修饰呢？这一猜想被证实是真实存在的，作者通过MALDI-TOF-MS方法检测到成熟体miRNA的甲基化修饰，而且进一步研究发现，miRNA成熟体的甲基化修饰可作为癌症早期诊断的标志物。研究导图
研究亮点miRNA成熟体的甲基化标记、甲基化水平与癌症的关联；MALDI-TOF-MS定量甲基化miRNA；癌症早期诊断标志物。研究结果一、作者首先检测了RNA甲基化酶在胰腺癌和正常组织中的表达情况，结果表明胰腺癌和正常组织之间的分布存在明显差异，miRNA甲基化酶表达水平倾向于在胰腺癌中上调，且细胞系在表皮生长因子刺激下，miRNA甲基化趋于增加。这表明确实存在RNA修饰的系统调节机制。RNA甲基化酶在胰腺癌中表达上调生长因子刺激后甲基化miRNA的比例增加

二、之后的转染实验结合靶标富集结果显示，未甲基化修饰、5mC修饰、m6A修饰的miR-200c-3p，它们结合的靶基因的富集结果存在差异，提示甲基化修饰会改变miRNA与靶基因的靶向结合作用。
靶标富集结果
三、为了研究甲基化修饰的miRNA是如何改变靶标的功能，作者进行了分子模拟以预测AGO蛋白与miR-17-5p,miR-200c-3p和let-7a-5p（甲基化或无甲基化）结合结构的变化。结果显示m6A修饰会造成整个复合体（包括RNA识别位点周围）发生较大的结构变化，从而影响目标RNA的识别效率。分子预测结果（m6A修饰）
四、作者提出了MALDI-TOF-MS定量甲基化miRNA，该方法通过质谱检测确定甲基化碱基。与常规 bisulfite sequencing和RNA immunoprecipitation followed by RNAsequencing (RIP-Seq)相比，质谱法的灵敏度更高，无偏好性，并且能够发现新的修饰位点。作者发现有趣的现象：定量逆转录PCR结果中，肿瘤与正常组织中一些miRNA的表达水平没有明显差异。然而通过MALDI-TOF-MS方法定量甲基化miRNA，发现这些miRNA的甲基化比率在肿瘤中明显高于正常组织，提示甲基化修饰可作为肿瘤潜在的生物标志物。MALDI-TOF-MS定量甲基化miRNA甲基化miRNA比率与定量逆转录PCR结果五、为了进一步评估miRNA甲基化作为早期癌症诊断的生物标志物的潜力，作者检测了来自胰腺癌患者和健康对照的血清样品中的miRNA甲基化水平。不出所料，在所有胰腺癌患者样品中检测到甲基化的miR-17-5p水平，在健康血清中不存在或仅以低水平存在。此外，在检测早期胰腺癌方面，其诊断能力明显优于CA19-9和CEA（CA19-9和CEA是已建立的生物标志物）。miRNA甲基化在正常组和胰腺癌中的统计，及其与CEA和CA19-9的对比
研究结论评估miRNA甲基化而不仅仅是其表达水平，可作为一种有前途的诊断策略。阐明甲基化在癌症不同阶段调控microRNA功能的机制，可能有助于靶向治疗的发展，从而改善患者的预后。由于癌症的早期发现和治疗可以对患者的预后产生实质性的影响，因此筛选癌症的新方法可能至关重要。鉴于现有癌症生物标志物的优势，RNA甲基化可能成为未来早期癌症检测系统的一个重要组成部分。参考文献：1. Alarcón CR, Lee H, Goodarzi H, Halberg N, Tavazoie SF. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 2015;519(7544):482-52. Ma JZ, Yang F, Zhou CC, et al. METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6-methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing. Hepatology. 2017;65(2):529-5433. Konno M, Koseki J, Asai A, et al. Distinct methylation levels of mature microRNAs in gastrointestinal cancers. Nat Commun. 2019;10(1):3888

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