NGS一线PM解析文库上机测序要点

坐在自己的岗位上，每天对着一个个项目的文库名称，一条条lane/FC的编号，面对一大堆从测序仪上下来的原始数据fastq，检查服务器中的数据有无报出什么异常，将系统中的完整下机项目加入分析以及将补测清单通知到各个产品线项目管理。想必大家应该猜到我的岗位了，对了，我就是在高通量测序行业一线的测序管理专员。本人不是大的技术咖，但是可以很通俗的跟大家叨叨NGS和NGS项目周期哦。

平时，大家总是跟我说，小菜妹妹，“我这个项目位于哪条lane/FC上，什么时候能下机呀？客户急着要结果呢！“一般我都是朝他大声道：自己查系统！但是要说为什么她这个文库已经建完了，上机周期有超期风险了，其中原因，我是有很丰富的经验呢：

首先说一下最最基本的，文库质量要过关：

文库质量

上机文库的质量非常重要的，那么这个“质量“具体又从哪些点上体现呢？

1文库片段长度

一般我们要求每个混样文库的片段长度在200~600bp，整lane平均长度在400bp左右，低于100bp的片段文库我们称之为引物二聚体，100~120bp之间的为接头二聚体，超过700bp的则为大片段，大小片段的存在都会影响最终整lane的数据量产出；

2文库的浓度体积

上机文库要求浓度≥5nM，体积>100ul，混样单个文库体积不低于0.5uL，为确保取样量的精准，需使用精度高的移液器，和带滤芯无核酸酶低吸附的枪头；

是不是很简单呢，平时说的建库多长时间完成，如果到了文库质量这一关没有过，那么就需要重新建库和文库质检，这种情况多发生于风险建库的核酸样本，比如DNA/RNA的起始量没有达到要求的标准。如果重新建库已经没有样本了，客户需要重新送样。

定量方法

这个需要特别拉出来讲一讲，虽然说文库质量标准有了，定量结果貌似是也是符合的，但是为啥我的项目文库测序后数据量不够，要补测，测序周期延长了呢？那就先得普及一下目前用的最多的仪器通量，先教会你查询

http://web.illumina.com.cn/landing/products_pdf.asp

我习惯使用官方网站，英文版的担心大家看起来费力，直接看中文网。看一下我们2019年第三季度仪器系统出货量达到史上第二高，并首次超过HiSeq X成为产出测序数据最多的Illumina系统NovaSeq:

看一下SP和现在的S4通量：

我们可以看到novaseq 6000 S4单个FC运行分4个lane上机，一个lane可以产出2x150bp 700多Gbases，一般会产出800多Gbases数据。这么多数据，肯定是很多的样本通过双端index凑在一起上机。那么定量的准确性对于我这些测序服务供应商来讲就尤为重要，直接影响到了成本与周期。我可是经历了仪器通量一升再升，从单端index升级到双端index提升通量的那波人。大家关于index，可以看官网上的这篇：标签错配对多重分析和下游分析的影响(http://web.illumina.com.cn/landing/documents/application_area/genetics/index-hopping-white-paper-770-2017-004-chs-v1-web.pdf?backurl=http://web.illumina.com.cn/landing/products_view.asp?newsid=267)

也可以看一个比较老一点的生信菜鸟团的微信稿：

也可以看我们的微信公众号上的这篇：

这些都是技术大咖关注的。

我们继续回到这里的影响成本与周期的文库定量上来，我们通常使用荧光定量PCR法来进行定量，每个文库定量是否准确关系着数据产出是否均匀。为了确认NGS文库的大小分布，一般使用Agilent_2100_bioanalysis作为主要手段。为了确认准确的浓度，还需要配备实时荧光定量PCR仪和Qubit荧光定量仪，测序技术员会告诉你这两个定量方式的差异。

最后，我得跟大家普及几个特殊的文库类型：

文库类型

先讲一下所有的类型，我眼里的文库类型分为2大类，自己可以自行去官网看哦：

http://web.illumina.com.cn/landing/products_pdf.asp?lx=typ&superior=16&Typeid=44

我今天要着重跟大家讲的是，在混库上机时需要特殊对待的傲娇测序服务类型吧~，不能把他们当做普通文库来评估成本和周期呢。

全基因组甲基化文库（WGBS）文库

那可是一不小心产出就能高到堪比珠穆朗玛峰的啊，众所周知WGBS文库是出了名的碱基不平衡文库，GC含量较低，所以在混样时，必须要加入碱基平衡文库，比如像转录组，基因组等等文库；并且，一条lane中，排机数据量万万不可多，以novaseq平台上机来说，一条nova文库中WGBS数据量排机在80G左右，否则就能影响整条文库的测序质量，可一定要慎重啊！话说回来，虽然WGBS他很傲娇，但也是有好基友的哦，那就是RRBS（简化代表性亚硫酸氢盐测序）， 他们都是一样的性情呢，所以也要小心他们哦~

需要加平衡文库上机的，除了以上几个特殊服务类型的样本，还有我们的扩增子文库，也就是16S/ITS测序项目，但是他们在测序时是需要测通的，所以不能跟其他普通的碱基平衡文库混样上机，这样我们就只能加入专业的平衡文库“phix”，一条用novaseq250PE上机的扩增子文库，通常我们会加入40%的phix以达到碱基平衡作用。那么这里可能有人会疑惑了，扩增子文库一般来说不应该普遍是用miseq300PE来上机测序吗？NO NO NO~毕竟我们联川是行走在行业内前端风向标，更新换代必须快准狠！novaseq250PE测序不仅能保证数据质量，而且通量和产出远远高于miseq，这样就可以大幅度缩短我们项目周期，何乐而不为呢。（更多关于16S测序升级novaseq250PE相关内容可查看联川生物公众号稿件“NovaSeq PE250更优的微生物组测序平台”“微生物组16S测序又有大动作！升级至NovaSeq PE250，数据量免费升至5万Tags”等）。

好了这次我们就先说到这吧，如果你有在文库测序上遇到的趣事，可以给我们留言分享呀~下回见咯

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