用户文章Cell Stem Cell-波形蛋白在神经干细胞静默退出时协助聚集小体蛋白

论文标题：Vimentin Coordinates Protein Turnover at the Aggresome during Neural Stem Cell Quiescence Exit

刊登日期：2020年02月

发表杂志：Cell Stem Cell

影响因子：21.464

研究机构：威斯康辛大学麦迪逊分校

联川提供：转录组测序/lncRNA测序（rRNA去除法dUTP建库）

摘要

在整个生命过程中维持健康的蛋白质组对于正常的体细胞干细胞功能至关重要，但是对受损或聚集的蛋白质增加的干细胞反应的复杂性仍然不清楚。
本文证明成年神经干细胞（NSCs）利用聚集小体蛋白从破坏的蛋白稳态恢复，并描述了蛋白稳定中的中间丝波形蛋白作为蛋白酶体到聚集小体蛋白（也叫聚集体）的空间协调者的新功能。在缺乏波形蛋白的情况下，NSC退出静默状态的能力降低，此时需要NSC清除一堆聚集小体蛋白，并显示出早期年龄依赖性的增殖和神经发生性下降。综上所述，这些数据揭示了波形蛋白和聚集小体蛋白在静默的NSC激活过程中在蛋白稳态调节中的重要作用。
背景介绍

适当的体细胞干细胞能否维持终生组织功能取决于细胞维持蛋白稳定的能力，蛋白稳定是蛋白质合成和降解之间的平衡，并受蛋白质途径网络控制。不能维持蛋白稳态会导致蛋白质折叠错误，受损或聚集，这是衰老的标志，并且与干细胞功能障碍有关。
干细胞调节这种失衡的一种方式是通过有丝分裂，在这种情况下，它们可以将受损或泛素化的蛋白质不对称地分离到一个子细胞中。神经干细胞（NSC）在有丝分裂期间将泛素化的蛋白质与中间丝状体（IF）波形蛋白共分离，这表明波形蛋白是蛋白质清除的参与者。尽管许多研究调查了IF在NSC中的作用，揭示了IF Nestin在发育过程中的重要作用以及磷酸化波形蛋白在NSC分化中的作用，但波形蛋白在NSC中蛋白质清除中的作用仍然未知。先前已在细胞系中显示，在蛋白稳态受损后，累积的错误折叠或损坏的蛋白质可被转运至中心体并被波形蛋白笼子包围，形成一种称为聚集体的结构。尽管人们对聚集体的形成方式知之甚少，但它们的内源性作用以及它们如何特别增强从破坏的蛋白稳态中恢复的能力仍不清楚。在这篇文章中，作者将要证实神经干细胞是否利用聚集体来维持神经干细胞的蛋白稳态，波形蛋白在这些结构中起什么作用。标记内源波形蛋白在原代小鼠神经干细胞中以监测聚集体的形成作者使用CRISPR技术在小鼠神经干细胞SC中对波形蛋白添加了一个独特的荧光标记蛋白mNeon，并通过大量实验证实这个标记蛋白不会干扰影响NSC生物学功能。
NSCs形成波形相似的动态波形蛋白笼（cage）。作者确认波形蛋白包裹在聚集蛋白周围。因为波形蛋白mNeon包围了K48连接的富含聚泛素（K48pUb）的聚集体，Proteostat标记的聚集体以及在中心体中过表达的易于聚集的蛋白质。作者发现热休克，蛋白酶体（MG132）的抑制和自噬（氯喹）的抑制会增加形成波形蛋白笼的NSC的百分比，而引起DNA损伤的药物（5-氟尿嘧啶和依托泊苷）或内质网应力（衣霉素和毒胡萝卜素）不会影响波形蛋白cage的形成。这些实验证实，NSC专门针对蛋白质变性丧失而形成聚集体。波形蛋白在NSC中并不一定会形成聚集体尽管有波形蛋白在该聚集体上的报道，但其作用尚不清楚。为了确定波形蛋白是否对于形成聚集体是必要的，作者首先使用CRISPR/Cas9在原代小鼠海马NSC（KO）以及空白处理的对照NSC中创建了三个波形蛋白敲除（KO）系。
KO NSC的IFs胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Nestin的表达降低，但在NSC的增殖，分化或运动性方面无差异。为了确定是否需要波形蛋白来形成聚集体，作者用MG132处理了WT和KO NSC，以诱导错误折叠或受损蛋白质的增加，并发现WT和KO NSC均在核海湾中形成了K48pUb聚集体。这些数据表明波形蛋白对于形成聚集体或基本的NSC功能并不是100%必需的。   波形蛋白与蛋白质在维持NSC蛋白质稳态中很重要为了确定聚集蛋白与波形蛋白相互作用的蛋白，作者在控制和MG132胁迫条件下，在波形蛋白-mNeon NSC中对mNeon进行了免疫共沉淀，然后进利用LC-MS/MS鉴定与波形蛋白直接或间接相互作用的蛋白。有趣的是，与胞浆mNeon转染的对照无标签NSCs相比，作者发现了存在于蛋白质稳态的重要结节，例如热激蛋白和用于蛋白重折叠的伴侣，核糖体蛋白和用于蛋白翻译的延伸因子，以及用于蛋白的蛋白酶体降解。这些结果表明波形蛋白是蛋白质的组织者，其调节蛋白质合成，复性和降解的平衡。波形蛋白在细胞应激反应中将蛋白酶体空间定位于聚集体
蛋白酶体是主要加工多泛素化蛋白质降解的多亚基蛋白质复合物，先前已在聚集体和包涵体中鉴定出来，也存在于波形蛋白相互中。作者通过一系列手段证实波形蛋白笼中富含蛋白酶体，作者在NSC中的聚集体处检测到蛋白酶体信号，证实波形蛋白之间的相互作用和蛋白酶体。有趣的是，蛋白酶体和波形蛋白之间的相互作用在无应力条件下也沿着波形蛋白细丝存在，这表明在应力作用下，波形蛋白细丝塌陷到核海湾后，这些相互作用得以维持，从而使蛋白酶体变成了聚集体。令人惊讶的是，尽管KO NSC仍然可以形成聚集体，但聚集体上没有蛋白酶体的富集，这表明波形蛋白是将蛋白酶体定位到聚集体所必需的。因此，在KO NSC中，蛋白酶体介导的聚集体蛋白更新可能会受到损害，并可能影响其从破坏的蛋白稳态恢复的能力。波形蛋白敲除NSCs表现出降低的失去蛋白稳态的能力
为了回答KO NSC在无法将蛋白酶体递送至聚集体时受到蛋白质变性丧失的挑战时会如何反应，作者创建了压力和恢复2个条件实验。尽管从根本上说，WT和KO NSC中聚集蛋白的量没有差异，但是由于破坏了蛋白稳态，KO NSC在此过程中聚集蛋白的水平却显着增加恢复。该发现表明KO NSCs不能降解由于用MG132抑制蛋白酶体而积累的蛋白质。为了更好地了解聚集蛋白形成的时间动态，作者在WT NSC的MG132治疗期间的不同时间点，测量了总多聚泛素化蛋白水平和Proteostat标记。作者发现，用MG132治疗后，泛素水平升高并得以维持，这表明当泛素化蛋白无法降解时，它们会聚集。此外，走着观察到在聚集体处K48pUb蛋白与Proteostat标记的聚集蛋白之间存在高度共定位。这些数据提出了一个模型，其中KO NSC中缺乏蛋白酶体定位到聚集体可能导致折叠错误或多泛素化蛋白的降解效率低下，从而导致聚集蛋白增加。接下来，作者想要验证KO NSC中蛋白质变性丧失后聚集蛋白的增加量是否会影响NSC行为。根据应激和恢复2个条件实验，作者发现尽管WT和波形蛋白在基础条件下与经过DMSO处理的KO细胞相比没有明显差异，但MG132破坏了蛋白质结构，导致KO NSC中2或8天的恢复期增殖减少。因此，尽管基本KO NSCs没有明显上表型的改变，但是在蛋白稳态破坏后的恢复过程中，它们的聚集蛋白水平显着增加，并且增殖减少，即使延长恢复时间也无法改善。NSC敲除波形蛋白后不改变蛋白酶体表达和活性为了确认这些作用并非归因于KO NSC中蛋白酶体成分的差异表达，作者对WT和KO NSC进行了转录组测序，发现蛋白酶体成分的mRNA水平没有差异。此外，为了确定KO NSC中的蛋白酶体功能是否发生了改变，作者对两者进行了蛋白酶体活性测定。所有检测到的胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和半胱天冬酶活性的底物在失去蛋白质稳定后恢复期间，WT和KO NSC中的蛋白酶体活性水平相似，表明KO NSC中的蛋白酶体具有正常功能。这些实验表明，KO NSC中蛋白酶体的表达或活性没有变化，由于KO而使蛋白酶体缺乏空间定位于聚集体可能是KO NSC中蛋白质聚集增加和增殖降低的主要驱动力。KO NSC调节自噬以响应聚集蛋白水平的增加细胞蛋白质降解的另一个途径是自噬，自噬吞噬与酸性溶酶融合的大聚集体以降解蛋白质。与之前的观察结果一致，作者在DMSO条件下未观察到WT和KO NSC之间的差异，但经MG132处理后恢复期间，KO NSCs的自噬通量增加，LC3II水平升高表明，KO NSCs是更依赖自噬来恢复蛋白稳态。同样，在用MG132处理以破坏蛋白稳态后， KO NSCs表现出自噬通量增加，表明溶酶体的利用增加。MG132处理后溶酶体的这种增加以及KO NSCs的恢复也可以通过LysoTracker观察到。这些数据支持了一个模型，即无法将蛋白酶体在空间上定位于聚集体，聚泛素化的蛋白质开始聚集，KO NSC增加了自噬，从而增加了聚集清除率。波形蛋白在静态qNSC中被下调并且仅在Exit形成Cage最近的研究表明，脑室下区域（SVZ）的静态NSC（qNSC）具有增加的蛋白质聚集体水平，这些蛋白质聚集体在激活进入细胞周期时会通过自噬被清除。
使用成熟的方案在体外诱导NSC静默，作者发现静默的原代小鼠海马NSC蛋白质聚集体的水平增加了，在静默退出时被清除了。接下来作者发现，qNSCs下调波形蛋白水平，令人惊讶的是，在蛋白质聚集体增加的情况下，它们不会形成波形蛋白的笼子。在静默退出期间作者发现波形蛋白在BMP4去除后的第一个细胞分裂之前被上调并在相间形成笼子，导致波形蛋白笼子不对称遗传给一个子细胞（daughter cells）。有趣的是波形蛋白的mRNA在qNSCs中上调，这表明NSCs被激活以在上调和激活过程中通过上调和笼形成来响应。KO NSC的体外退出静默的能力降低为了测试波形蛋白是否一定会影响静默状态退出，作者在WT和KO NSC中诱导了完全静默，然后开始了向激活的过渡。在此过渡过程的48小时中，作者发现波形蛋白KO NSC的聚集蛋白和溶酶体水平增加，与MG132处理后破坏蛋白稳定的结果相似，并提示激活过程中蛋白质降解受到损害。此外作者还发现波形蛋白KO NSCs的增殖减少，退出静默状态的能力降低。波形蛋白KO NSC中静默退出期间的增殖率约为一半，表明这不是驱动静默退出的唯一机制。由于之前已经有论文（pubmed：29590078）证明自噬会导致静默退出，作者在WT和波形蛋白KO NSC中诱导了静默，这次添加了氯喹来抑制静默退出时的自噬。作者发现波形蛋白KO NSC处于静态激活过程中的自噬抑制作用使NSC完全无法退出静默状态，这表明波形蛋白的笼罩和蛋白酶体定位以及自噬在NSC的静态退出中发挥了作用。静默退出期KO NSC不能在有丝分裂过程中不对称地分离蛋白酶体作者NSC在静默退出时不对称地分离波形蛋白，这表明波形蛋白可能参与有丝分裂期间协调不同细胞货物（如聚泛素和蛋白酶体）的不对称分离。为了解决这个问题，作者在静默退出时对波形蛋白进行定量。在WT中，K48pUb和蛋白酶体在有丝分裂过程中主要是由子细胞不对称地遗传的，子细胞继承了更多的波形蛋白。波形蛋白KO NSC保留了在有丝分裂过程中不对称分离K48pUb蛋白的能力，波形蛋白不参与聚集体形成。尽管K48pUb蛋白的不对称分离不需要波形蛋白，但波形蛋白对于有丝分裂期间蛋白酶体的不对称分离至关重要。这些数据表明， KO NSC不对称地将多泛素化蛋白分离给子细胞，却没有为她们提供丰富的蛋白酶体来清除这种负担。NSC不对称地分离聚集体若要确定波形蛋白笼子的形成和有丝分裂过程中波形蛋白的不对称分离在体内生理环境中是否保守，作者进行了免疫荧光观察7周龄小鼠体内（in vivo）的齿状回（dentate gyrus）中的内源波形蛋白丰度。
尽管脑切片中的NSC分裂很少见，但作者在分裂的NSC中观察到波形蛋白的不对称分离，与体外（in vitro）结果吻合.此外，作者还观察到波形蛋白在相间少量NSC的nuclear bay中富集。这些数据共同表明，在小鼠体内NSCs在静默退出时可以利用聚集体。波形蛋白KO小鼠中的NSC具有降低静默退出的能力由于波形蛋白KO导致体外退出静默的能力降低，并且由于作者已经观察到波形蛋白笼在体内形成，因此作者怀疑波形蛋白KO动物是否表现出降低的NSC体内退出静态能力。先前大量研究已经证明，在替莫唑胺（TMZ）处理后，分裂的NSC耗尽，导致qNSC激活以补充种群。作者在WT和波形蛋白KO小鼠中进行了3天的TMZ注射，然后进行了3天的恢复期。在灌注之前，小鼠接受了3次EdU注射。作者发现，与WT小鼠相比，TMZ处理后波形蛋白KO NSCs的颗粒下区（SGZ）中的EdU +细胞水平降低，这表明波形蛋白在体内海马NSC有效地静默退出必不可少。最近有人提出，导致衰老过程中神经发生减少的主要因素是静默时间的增加，这表明波形蛋白KO动物可能在衰老过程中维持较快的增殖和神经发生衰落。为了测量不同年龄的成人神经发生的差异，作者在灌流前每天对7周龄，5个月龄或9个月龄的WT和波形蛋白KO小鼠进行4次EdU注射，总计共4天。作者发现波形蛋白KO小鼠在NSC增殖和神经发生上，年龄依赖性下降更快。但显示出相似数量的NSC，表明波形蛋白KO NSC难以退出静默状态，并且进一步支持波形蛋白在NSC静默退出中的重要作用。
总结

qNSC激活已被越来越多地视为神经发生的关键障碍之一。一些研究表明驱动qNSC激活的一个关键因素是蛋白稳态的转变，其中清除了一堆聚集蛋白（Proteostat）。自噬的诱导增强了这些聚集蛋白的清除率并提高了qNSC激活的速率，这表明qNSC的激活能力与清除聚集蛋白的能力之间存在直接联系。本研究进一步证实了以下发现，即qNSC在海马NSC中携带了增加的阳性聚集蛋白负荷，并提供了聚集体形成机制，作为qNSC在qNSC激活过程中增加蛋白质更新的一种手段。在衰老期间，神经干细胞退出静默状态的能力下降。尽管身体的其他区域（包括其他干细胞小生境）在啮齿类动物的衰老过程中会随着年龄的增长而发生变化。但海马NSC的增殖率却会在2个月内下降，并在9个月时达到饱和。作者发现，随着时间的推移，波形蛋白KO动物中NSC的增殖和神经发生更迅速地下降，进一步支持波形蛋白在调节体内静态退出中的作用。作者的研究提供了关于波形蛋白在聚集体上的功能已有早就被大量论文证实。这些研究证明了波形蛋白在聚集体中与蛋白稳定相关蛋白的组织者的作用，并且是NSC中蛋白稳定的关键调节剂。此外，本文为生物系统内的聚集体提供了一种功能，即作为NSC在qNSC激活过程中用于清除蛋白质的程序。本文旨在了解驱动波形蛋白笼形成的机制，有丝分裂过程中总的不对称性作为干细胞调节机制的重要性以及将这些发现应用于其他细胞类型的研究铺平了道路。
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