ScRNA-seq上游的流式分选要注意些什么 | 单细胞专题 摘要：流式分选实验中容易被忽略的一些“坑”

尽管基于10×Genomics可以开展高通量的不同类别的细胞鉴定和分类，仍然有不少实验需要先进行流式分选，再对分选得到的大类细胞进行高通量的更细致的鉴定和分类。获得高质量的单细胞测序（scRNA-seq）数据依赖于在建库之前快速而小心地捕获单个活细胞以防止RNA降解。成功的开展分选实验是具有挑战性的，需要对FACS技术进行仔细的规划和优化。以下给出一些需要注意的地方（Tips），帮助你避免分选实验中常见的一些“坑”。

图 各种单细胞分选技术

Tip1. 不要堵塞分选仪

没有什么比堵塞流式细胞仪更糟糕的了！这会放慢分选速度，损害你的样本。因此，你需要确保你的单细胞悬液中没有细胞碎片和团块，这可以通过离心，细胞过滤器，或其他方法来去除。优化你的解离方法，在不影响细胞活力的情况下，最大限度地增加单细胞的数量。由于Mg2+[A1] 和Ca2+[A2] 是许多粘附分子所必需的，建议细胞（bulk cell suspensions）用冷的并且经过滤的1×PBS（不含EDTA、Mg²⁺上标和Ca²⁺，并添加1–2% BSA），或使用BD FACS预分选缓冲液（Cat. # 563503，含有一种血清蛋白可以帮助维持细胞活性）进行悬浮。你可能完全没想到，悬浮在培养基中的细胞的活性仍然会受到损害，并经常会抑制cDNA合成。强烈建议在分选前使用细胞活性染色，以最大限度地捕获活的单细胞。
Tip2. 温柔地处理细胞

流式细胞分选过程对细胞来说很粗野，但你可以做一些事情来减少细胞在分选过程中的损伤和裂解。除了遵循Tip 1中的预分选缓冲液指引外，建议使用较大的喷嘴尺寸和较慢的流速，特别是对于脆弱的细胞类型。对罕见的细胞类型进行分选，特别是在低流速下，会非常耗时。因此，你需要考虑在FACS之前使用预浓缩步骤或是两步法分选策略。
Tip3. 将细胞分到容器底

这看起来似乎很简单，但却是一个常见的问题。请确保您的流式分选仪已经过校准，能够将含有细胞的液滴准确地分到培养板/收集管中。如果你的培养板/收集管没有正确对齐，细胞可能会落在边缘，这会使细胞很快脱水导致RNA降解。更糟糕的是，这些细胞可能根本不在容器中。你也可以了解这些质量控制方法，如使用荧光珠，校准微球，甚至石蕊纸，以确保液滴的正确输送。
Tip4. 分选入裂解缓冲液

一旦细胞分选完成，应尽可能快地将它们的转录组固定下来。如果是做SMART-Seq，建议将其置于含有RNase抑制剂的冷的并且新鲜配制的裂解缓冲液。一旦细胞沉积在培养板/收集管中，应以100 g温柔离心15-30 s。如果不立即进行cDNA合成，将样品置于干冰上速冻，然后放置在-80 °C可以保存数周。如果是基于10×Genomics 的scRNA-seq，分选出来的细胞需要重悬到不含Mg²⁺和Ca²⁺离子的缓冲液中（可以添加10% FBS或者最多2% BSA），测定细胞活性（要求＞85%），调整细胞浓度700～1200 cells/μL，尽快上机。
Tip5. 寻求帮助

FACS操作是复杂的，每种分选仪都各有不同。在开始实验前，请与你的流式细胞仪制造商或者负责仪器操作的技术人员讨论你的实验和需求。这些专家可以帮助你把流式分选实验做正确。最后，祝分选愉快！参考文献Rodrigues, O. R. & Monard, S. A rapid method to verify single-cell deposition setup for cell sorters. Cytom. Part A 89, 594–600 (2016).Zigon, E. S. et al. A rapid single cell sorting verification method using plate-based image cytometry. Cytom. Part A 93, 1060–1065 (2018).
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