听说你需要一步到位的质检报告信息？

什么是质检

顾名思义，质检就是质量检测。采用一定检验测试手段和检查方法测定产品的质量特性，并把测定结果同规定的质量标准作比较，从而对产品做出合格或不合格判断的质量管理方法。

RNA质检也是通过一些手段和方法来判定RNA是否达到标准。

Agilent生物分析仪已经取代了传统的凝胶电泳技术成为RNA质量控制（QC）的行业标准。分析仪器的小型化与常规技术相比具有诸多优点。主要优点是提高数据精确性和重复性，缩短分析时间，最大限度的降低样品消耗，提高复杂工作流程的自动化和完整性。

Agilent 2100的RIN值量化评估被行业视为RNA质量评估的黄金标准，但Agilent 2100的检测通量却是其致命短板，40min只能检测12个的样本的通量，大大拉长项目的执行周期。

但是在近年，Agilent 4200投入使用。新型 Agilent 4200 TapeStation 系统是 Agilent 样本质控的最新力作，它结合了 2100 生物分析仪在 RNA 质控上的出色能力，继承了 2200 TapeStation 在 DNA 完整性评估上的突破，同时融入了自动化与高通量，几乎达到了1min检测1个样品的速度，是 NGS 测序中核酸样本片段质控的理想解决方案。

对于新产品，有些老师可能会有些犹豫，不希望自己的样品在质控方面出现什么问题，所以会出现要求使用2100质检，根据安捷伦推出的数据，4200在质控方面具有和2100一样出色的能力。A、B两个样品分别2100、4200质检，得到的峰图基本一致，RIN也相差不大。所以老师无须担心那种质控方式会有影响。

了解质检图

熟悉质检图上各种基本信息及所在位置，能够第一时间找到自己所需信息。

好的质检图最基本的两点，一是峰型要锐利，二是基线平稳、干净。峰型锐利没有弥散，说明RNA没有或很少有降解；基线平整、干净说明没有或很少有其他杂质，也没有人为操作上的失误（压胶，芯片空中出现气泡等）。

真核动物、植物与原核生物质检图

动物样品峰图为28S、18S，植物样品为25S、18S，原核样品为23S、16S（当然还有5S、5.8S）。为了增大质检通量一般动物样品使用Agilent 4200 Bioanalyzer分析，植物组织使用Agilent 2100 Bioanalyzer分析，原核生物通过选择原核模式两者都可以使用进行分析。4200有原核模式和真核模式选择，官方介绍可以跑植物，但是我们测试发现不适用于植物样本。

特殊峰形图

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现特指直径在40-100nm的盘状囊泡。其峰形图在25 nt前有一个“凸凸”。植物内生菌的质检图呈现4个峰型，是由原核菌类的16S、23S、和植物根18S、25S组成。

节肢动物的单峰。28S在热处理（部分自然情况下）发生断裂，产生了2个小片段：28Sα和28Sβ，28Sα和28Sβ与18S重叠在一起形成了单峰趋势，而未经热处理的RNA并未出现这种现象。28S的两个片段由氢键连接，热变性使得28Sα和28Sβ之间的氢键发生断裂，沉积在18s rRNA附近，形成单峰。

RNA质检判定的标准

1、RNA样品总量是否有达到后续实验所需起始量

通过Nanodrop紫外分光光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA含量

上样量：2 uL，浓度范围：2-1800ng/uL。

OD230：杂质（酚、糖原等碳水化合物）的吸光度；

OD260：核酸的吸光度；

OD280：蛋白质的吸光度。

OD260/OD280：1.8-2.4，低于1.8表示有蛋白质的污染。  

OD260/OD230：1.5-2.4，低于1.5表明有明显的有机物如糖、肽、苯酚等的污染。

OD值过低会对RNA定量有影响但是对后续建库没有太大影响，如果老师您很在意这一点的话可以考虑对RNA进行一次纯化。

2、RNA的完整性鉴定

RNA完整性鉴定的方法，使用Agilent 2100、4200 Bioanalyzer来鉴定RNA完整性。

2.1 RIN值

RNA Integrity Number（RIN）数值大小即反应样品完整性情况，范围在1~10，数值越接近10表明样品完整性越高，反之RIN值越小完整性越差。

2.2 28S/18S、25S/18S

28S/18S也可作为评估样品完整性的一项指标，真核生物的比值大于等于1.5 表示RNA完整性较好，如果比值较低，则表明RNA有不同程度的降解。但是还是会有一定局限性的，比如降解样品28S/18S比值还是有可能出现大于1的情况，所以需要结合其他指标进行评估。

小结

RIN值、28S/18S，作为独立评估RNA完整性的指标是不太准确的，我们需要结合峰图的实际情况进行评估。

系统读取错误，系统评估RIN为2.3，（图A）结合峰图，基线平稳干净，峰形锐利，25S/18S比值正常，所以我们判定其完整性良好，可以进行下游实验。因此被认定为仪器分析问题，在其错误栏中也会有错误提示。如针对图A的错误分析是“Unexpected signal in preregion”。

单峰28S/18S=0，作为一种特殊峰形（图B），不仅在昆虫等节肢动物出现，在啮齿动物如小鼠的肺组织、细胞都有出现过，目前哺乳动物断裂原因尚不明确。所以不应该将这种非典型的RNA归于降解，这种现象对后续建库和数据质量并无影响。

对于一些看似降解较严重，（图D）。18S前有大量细小峰形，与降解样品相比较，弥散程度较低，峰形比较尖锐。而18S、28S比较完好，认定为有部分降解，细小峰形也有可能是这个样品带有的其他RNA分子。我们会判定它后续实验合格或者风险。

在判定原核污染、有叶绿体rRNA存在的样品是否合格有两点

①原核污染程度、叶绿体rRNA占比大小（图A为原核污染，图B为含叶绿体样品）：原核污染程度高或者叶绿体rRNA占比大，我们会放弃下游实验。原核、叶绿体RNA占比太高会严重影响有效数据量。

②对不同的服务项目（原核污染、叶绿体rRNA占比较低）：

转录组、降解组建库呢主要通过磁珠抓取带有PLoy A尾mRNA，而原核生物不存在PLoy A尾。在原核污染、叶绿体占比较轻微的情况下，通过增加RNA起始量或者后续补测来满足需求。

Lnc、CircRNA建库则对Lnc、Circ对原核要求比较高，是通过特异性探针匹对去除rRNA，达到纯化的目的。但是不能去除原核RNA，对叶绿体RNA的去除效果也不明显。也没有有效的手段来估测原核污染或叶绿体RNA所占比，对有效数据量影响较大，会判定不合格，不符合下游实验。

降解问题

关于质检最常见也最关注的就是样品RNA的降解问题。关于这一点实验室大佬亮哥给我们分享了一篇文章。

题为RNA-seq：impact of RNA degradation on transcript quantification。

想知道细节部分可以去看看。

这次主要罗列下结论：

1、RIN值对后续的分析会有一定程度影响：一般RIN值高于6.3的样本分析结果较为准确，受到RNA降解影响较小。

2、RIN值7.0和9.0的样本在后续分析中效果不明显，也就是说RIN值7.0和9.0对后续建库的区别不大，都挺好。

3、我们也可以从低RIN值的样本中得到一些有效数据，比如本文研究中，RIN值为4的样本也可用来鉴别个体间差异。具体情况还要考虑基因的表达水平、降解速率等。

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