我的候选基因里没有SNP和InDel变异，是定位错了吗？| 群体遗传专题

我们在利用BSA或者其他方法精细定位候选基因后，可能会发现双亲在该区间没有多态性，是否就说明定位区间是假阳性的呢？其实并不不一定。不同物种的表型分子机制丰富多样，有SNP引起的，有InDel引起的，有外显子变异引起的，也有启动子区域变异引起的。目前的基因定位和克隆研究中多数是这种情况。但是也有少部分由DNA的甲基化引起，典型的比如“春化”作用中低温改变甲基化状态调控FLC基因的表达进而影响植物开花（Sheldon et al., 2000; Berry et al., 2015）。最近北京市农林科学院张丽课题组在Journal of Experimental Botany上发表的一篇萝卜食用根颜色性状分子调控机制就和甲基化有关（Wang et al., 2020）。作者结合了QTL-seq和转录组分析确定了控制萝卜食用根颜色性状的候选基因（RsMYB1），该基因负责红肉萝卜中的花青素积累。但是，在红肉（MTH01）和白肉（JC01）系中的RsMYB1基因的编码区和调控区中未发现序列变异。随后的分析表明，主根白肉突变体是RsMYB1启动子中DNA甲基化改变的结果。下面就具体的阐述下本文的思路和方法。

作者的双亲选用衍生于红肉绿皮的地方种“心里美”的自交系MTH01，由MTH01突变的白肉材料JC01。之后构建了一个包含646个子代的F2群体用于基因定位（此外，还有F1以及BC1用于判定该性状的遗传规律）。又收集了111个萝卜的栽培种/地方种（含红肉，淡绿色肉，白肉表型）用于候选基因的单倍型分析。萝卜的颜色表型用HPLC测定花青素含量量化。

基因定位用QTL-seq的策略，依据F2群体的表型，构建了白肉和红肉的混池，每个混池包含30个个体，每个混池每个个体平均测序2X。精细定位采用KASP分型技术，在QTL-seq初定位的区间设计引物，在双亲和646个F2子代进行genotyping，并构建QTL区间的连锁图谱，结合表型QTL定位。

为了辅助候选基因的筛选，对双亲进行转录组测序以及qRT-PCR验证。

通过QTL-seq将QTL定位在7号染色体2.08Mb的区间。在该区间设计KASP引物，连锁分析后发现仅有R7-17024168标记和性状紧密连锁。无法确定区间，作者又重新更换了参考基因组序列（Aokubi DH）后重新进行QTL-seq分析，这次定位区间总共有281 Kb，其中包含了16个候选区间。其中6个scaffolds通过BLAST锚定到候选区间。转录组测序发现6个scaffold中注释到183个基因，其中9个在双亲之间有差异表达。2个基因（MYB1和MYB2）被注释参与花青素合成，均为MYB类型的转录因子。通过RT-PCR分离到其中的MYB1。序列比对发现MTH01中的MYB1序列和参考基因组中存在1-3个SNP，其他分析也表明MYB1更有可能是控制颜色的基因。

精细定位的思路（精华）

通过long range PCR 和染色体步移克隆了亲本MTH01中MYB1基因的编码区和promoter区。这时候，故事的高潮就来了。作者发现该基因在双亲之间缺少变异信息。此时，作者应该是非常痛苦，千辛万苦拿到的候选基因，竟然在双亲之间没有差异，应该也怀疑过人生。。。好在作者并未放弃，作者在双亲MYB1基因的上游154bp处发现有一个En/Spm家族的CACTA 转座子。通过查阅大量文献发现，该类型转座子在基因组上分布广泛，而且影响邻近基因的表达，这个信息提示作者，有可能是DNA的甲基化差异导致表型的差异。然后通过McrBC-PCR检测该转座子附近的甲基化情况，发现在亲本JC01的CACTA promoter区高度甲基化，在转座子上游甲基化程度却并不明显。作者继续使用亚硫酸盐处理对全基因组的甲基化鉴定。最终找到BS1位点，该位点处在双亲之间的甲基化差异显著，而且，亲本MTH01甲基化程度高于JC01。MTH01的嵌合突变体也支持CACTA promoter区甲基化和表型之间的关联。

后续就是互补的实验了，由于萝卜的转基因体系尚不成熟，作者仍然采用造突变体的策略，JC01亲本的种子，利用不同浓度的5-azaC处理，最终在3000个种子中发现了8个有表型变异的材料。在T1，T3，T4和T6代中均发现了根中花青素含量的上升，MYB1-CACTA表达也上调。其他的VIGS验证等实验就不再赘述。

靠谱er点评：本文过程还是非常曲折，首先一个是，由于不同物种参考基因组组装完整度差异较大，对于一些参考基因组组装一般的物种，在定位结果不好的前提下，可以考虑换个参考基因组重新BSA定位。其次就是筛选到候选基因后，发现双亲之间并无SNP或者InDel的差异，在确认各方面无误的前提下，就要考虑甲基化的差异导致表型差异了。另外，针对非模式物种，无法做转基因实验，考虑做VIGS，以及利用自然群体进行单倍型分析，让结果更加robust。最后靠谱er提示一下就是，基于一个较大规模的F2群体，进行BSA定位（或者Graded-seq定位），然后继续在定位区间内涉及SNP标记进行局部区域的连锁图谱构建和QTL定位，能更好的定位目标性状位点，同时结合转录组测序联合分析，加快候选基因的筛选。这个思路未来一段时间将会长期霸占精细定位思路的榜首。

参考文献

Berry S, Dean C. Environmental perception and epigenetic memory: mechanistic insight through FLC. The Plant Journal, 2015, 83(1): 133-148.

Sheldon C C, Rouse D T, Finnegan E J, et al. The molecular basis of vernalization: the central role of FLOWERING LOCUS C (FLC). Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, 97(7): 3753-3758.

Wang Q, Wang Y, Sun H, et al. Transposon-induced methylation of the RsMYB1 promoter disturbs the anthocyanin accumulation in red-fleshed radish (Raphanus sativus L.). Journal of Experimental Botany, 2020.

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