重金属对异源三倍体芒草奇岗根系微生物的影响 | 微生物专题

编者说：

环境污染的日益严重使得越来越多的研究者致力于生物修复方法的研究与开发，微生物在其修复过程中所扮演的角色也显得越来越重要。推荐相关领域的老师研究参考该研究的思路，不仅可以从植物的特性方面着手，还能借助高通量测序技术的优势，使得研究结果更加可靠完整。

发表期刊：Science of the Total Environment研究内容：重金属对异源三倍体芒草奇岗根系微生物的影响影响因子：5.589发表时间：2020年4月

研究背景

上个世纪以来，随着工业生产的日益繁荣，重金属（heavy metal，重金属）污染成为了最常见的土壤污染类型。有些重金属通过初级生产者进入食物链，对动物、人类和环境的健康构成了严重的威胁。此外，即使在没有或只有很少工业活动的偏远地区，由于化肥的使用和其他有机农田的应用，土壤中的重金属也有所增加。受重金属污染的土壤不能用于作物和饲料的生产。

传统的修复方法不适用大面积修复，并且修复成本高，需要特殊仪器和专业人员操作，还不能从根本上解决污染问题。重金属的复合污染不易分解，修复难度加大。而植物修复成本低，不破坏土壤结构，不造成二次污染。异源三倍体芒草奇岗（Miscanthus x giganteus）具有耐金属性、生物产量高和重金属植物修复作用的优点，被认为是一种具有潜力的工业原料和的绿色能源植物。本文主要研究重金属对异源三倍体芒草奇岗根系相关微生物群落的影响以及根系区域（如根际或内生）的不同响应模式。

实验方法

16S rRNA基因测序

样本类型：土壤、异源三倍体芒草奇岗根系

实验设计

温室试验土壤取材来源及重金属处理方式：用于温室试验所用的500公斤新鲜土壤来源于德国谢伦的一个长期农业生态研究农场（上部20厘米）。用5.7千克（干重）的土壤填充塑料罐（5升），并种植异源三倍体芒草奇岗根茎，其来源于遗传变异性很低的母株的根茎。在25/20°C昼夜温度、66%相对湿度和15h光周期的温室中生长，每盆植物每周用大约600毫升自来水浇水两次。在预适应5周后，在土壤表面施用醋酸铅（54.7 mg/kg dw）、硝酸锌（217.5 mg/kg dw）和醋酸镉（2.1mg/kg dw）。对于对照组，植物接受醋酸和硝酸铵（分别为43.7和267.2 mg/kg dw），使用相同的浇水程序，以排除醋酸和硝酸盐的影响，并用金属盐进行修正。每种处理有三个重复。在重金属处理14周后，植株达到开花期时进行取样。为了测定土壤中的重金属浓度和土壤理化性质，使用土壤取样器从罐中采集大块土壤，并将土壤分为三部分，大约5cm，储存在4°C下。每个深度层分别进行分析。

根系取样过程：将多余的土壤从根部摇晃下来，只留下附着力很强的土壤。为提取根际土壤，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液将根放入250毫升无菌离心管中，剧烈摇动和旋涡。离心后（10000×g）上清液丢弃，从根上冲洗出来的土壤被视为根际。然后将根放入新鲜无菌PBS溶液中，在冰上超声处理30s，离心（4700xg）。PBS被丢弃，剩余的土壤被认为是根表。最后用新鲜PBS对根进行两次以上的超声波处理，表面消毒（吐温80中2分钟，无菌矿泉水清洗4次，用70%体积乙醇清洗2分钟，3次清洗，用8%体积NaOCl清洗10分钟，8次清洗）并在层流罩中的无菌滤纸上干燥。根际、根表土壤和根在液氮中快速冷冻，并在-80℃下保存以提取DNA，使用PowerLyzer PowerSoil DNA分离试剂盒（Mo Bio Laboratories，Carlsbad，USA），然后进行扩增子测序分析。为了证明根表面消毒的有效性，使用16S rRNA基因通用引物将最后清洗步骤的水作为PCR反应的模板，并在2%（w/v）琼脂糖凝胶上未检测到扩增条带。

土壤总的金属浓度及CaCl₂萃取的金属浓度的测定方法：为了测定总金属浓度，干燥土壤样本和根系；筛分土壤样本并且粉碎根系。使用硝酸和高压消化器对均质植物样品进行压力消化。消化液在170℃下加热10小时。土壤样品按照ISO11466（1995）进行王水提取。随后，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法测量了消化液或王水提取物中的总铅、锌和镉浓度。根据文献报道，0.01 mol L^-1  CaCl2是评估重金属对植物有效性的最佳单一萃取剂。因此，使用0.01 mol L^-1  CaCl₂（1:4，w/v），从5 g干燥土壤中制备CaCl₂提取物。将样品在高架振动筛上振动45分钟，并通过0.45μm孔径的Millex高压过滤器进行过滤。在提取物中，用电感耦合等离子体原子发射光谱法测定CaCl₂可萃取金属浓度。

具体发现

1. 异源三倍体芒草奇岗根和土壤重金属含量

通过测定土壤和异源三倍体芒草奇岗根系的重金属浓度，发现在重金属处理的盆栽中测得的总重金属浓度在表层土壤中最高（表1）。在表层土壤中分别测定了Zn和Cd的浓度分别是0.15±0.18mg kg^-1（dw）和13.26±11.81μg kg^-1（dw），而深层土壤中的铅和其他金属含量均低于定量限（the limit of quantification，LOQ）。测定了生长在含有重金属的土壤环境下的异源三倍体芒草奇岗的根的重金属的含量，其中Cd含量为1.8mg kg^-1（dw），相当于施入的Cd的88.7%。根系中的锌和铅浓度分别为6.9和0.6mg kg^-1 （dw），分别为施入的锌和施入的铅的含量的28.9%和19.4%（表1）。研究表明，异源三倍体芒草奇岗根系可以吸收土壤中的重金属尤其是Cd。 

表1 对照和重金属处理下土壤和根部的重金属含量 

2.重金属对细菌生物量和总菌群的影响

qPCR测定了细菌16S rRNA基因的表达量，确认了根际和根表细菌生物量。由于植物叶绿体和线粒体中存在16S rRNA基因，因此没有对根内生菌进行qPCR分析。qPCR法测定的细菌生物量更多地是对细菌丰度的估计，而不代表绝对数。与未经处理的对照组相比，重金属处理没有导致被分析的任何根系区域中细菌生物量的显著减少。这一结果表明，不同处理间分类群相对丰度的差异是由基于扩增的基因条形码确定的，同时这种差异也代表了绝对变化。
从细菌α-多样性分析的observed species和Shannon指数可以看出，根际的丰富度最高（平均观测物种丰富度2377），根际的丰富度最低（平均观测物种丰富度1561）。在施用浓度下，重金属处理对任何根系区域的物种丰富度或多样性没有显著影响。
为了研究重金属施用对各根系区域的细菌群落结构的影响，采用排列方差分析和主坐标分析（PCoA）对β-多样性进行了分析（图1）。从PCoA的结果可以看出，重金属的施用对根际、根表和根内环境中的细菌群落组成没有显著影响（p>0.05），其中没有一个处理的3个生物学重复具有明显的分组。仅在根内胚层中，样品按主成分2出现了视觉分离，但差异不显著。

图1 PCoA分析

3.细菌对金属处理的反应
通过测序共获得7,015,656条序列，经过拼接过滤以及去除叶绿体序列，最终得到1,960,462条序列，分类得到6,621个 OTU 。从稀释曲线的结果可以看出细菌丰富度-稀释曲线趋于饱和，表明大部分细菌多样性被覆盖在所有样本中，这与基于丰富度的覆盖度估计器（ACE）和observed species结果高度相似。

图2 用DESeq2分析细菌对重金属(重金属)处理的反应(p < 0.05）A)根际B)根表 and C) 根内胚层

在本研究中检测到的6621个OTU中，有171个OTU（DESeq2分析）被鉴定为在不同处理下丰富度具有显著差异（所有差异丰富的分类单元如图2所示）。在根际和根表上也发现了相似的反应情况，分别有来自3个门的31和28个OTU对重金属处理有不同的反应。有趣的是，在根的内胚层，作者发现了最多的应答者:112个来自5个门的差异丰富的OTU。DESeq2分析发现了大量的显著应答者，但是作者认为重金属处理的主要应答者是那些在所有重复中差异倍数具有显著差异、平均相对丰度>0.1%的OTU。结果显示，在根际（OTU3941和OTU4046）和根表（OTU3941和OTU3859）中发现了主要的阳性反应物（在重金属处理的样品中更为丰富），均属于叶黄素杆菌属。在内胚层中鉴定出的主要阳性反应物被归为微小单孢菌属（OTU4379）。重金属处理的主要应答者在相应的区域高度丰富。在重金属处理下，根表区域中单个叶黄素杆菌（OTU3941）的相对丰度占平均相对丰度的3.7%。在重金属处理下，同一OTU在根际区域的相对丰度占平均相对丰度的2.7%。同样，重金属处理的根内胚层的微单孢菌OTU4379相对丰度占平均相对丰度的2.3%。对重金属处理有负反应的OTU主要分为链霉菌属（OTU5781、OTU5802、OTU6549、OTU6477和OTU5765）和拟无枝酸菌属（OTU5631）。为了测试金属应力的主要响应者是否显示出与OTU水平（如图2所示）和属水平相同的趋势，采用了t检验。为此，将所有分配给响应者所属的属的OTU的读数汇总为对照和重金属处理的样本。际黄体杆菌属（12个OTU，p=0.042）对重金属处理也有显著的属级响应（图3）。该属是根际和根表样品中最丰富的10个属之一。在重金属处理下，根际相对丰度和根表相对丰度分别为65.1%和65.8%。小单孢菌属在重金属处理下也表现出相对丰度增加的趋势，但差异不显著（p>0.05）。

图3 重金属和对照处理下根系响应在属水平上的相对丰度A)根际 B) 根表 C) 根内胚层

小结

异源三倍体芒草奇岗是一种耐重金属的高生物量植物。这使得奇岗具有用于重金属污染地区的植物修复和能源生产的能力。由于金属污染区的植物生长受到影响，在细菌的帮助下，它们的生长和植物修复效果可以得到改善。为了确定镉、铅、锌胁迫对奇岗根际微生物的正、负应答，作者设计了一个温室试验。以16SrRNA基因条形码为基础，采用独立分离的分子生物学方法，分析了根际、根表和根内生三个根室区域的细菌群落结构。此外，定量PCR（qPCR）用于细菌生物量的估算。结果表明，尽管根系大量吸收重金属，但根际、根表和根内生环境的生物量和细菌总多样性没有显著变化。总的来说，作者检测到6621个OTU，其中171个受到金属处理的影响。链霉菌和拟无枝杆菌类群则受到重金属处理的负面影响。在重金属胁迫下，根际和根表叶黄素杆菌和微小单孢菌的类群显著富集，相对丰度为0.1-13.7%。这些类群可能对奇岗在重金属污染下的表现具有重要意义，并且可能是未来开发新的生物菌剂以促进重金属污染土壤中的植物生长和植物修复的候选。

参考文献

[1] Alloway BJ. Sources of heavy metals and metalloids in soils. In: Alloway BJ, editor. Springer

Netherlands, Dordrecht, 2013, pp. 11-50.

[2] Arduini I, Masoni A, Mariotti M, Ercoli L. Low cadmium application increase miscanthus growth and cadmium translocation. Environmental and Experimental Botany 2004; 52: 89-100. https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2004.01.001.

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