联川生物RNA样本准备指南

1样本RNA得率以及各类项目最低起始量

各样本Total RNA得率统计（仅供参考）：

测序项目推荐起始量（起始量仅供参考，外泌体不允许18s/28s rRNA有峰）：

表达谱芯片及小RNA测序体液样本及外泌体项目起始量（仅供参考）

2各类样本准备指南

2.1 动物组织/临床组织采集

①   取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm，考虑到可操作性，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小

②   去除非研究的组织类型（如结缔组织，脂肪组织等），如果是临床病变组织的取材要正确判断病变以及正常组织，应将病变组织周围的正常组织去掉，反之亦然。

③   迅速用2-6℃预冷RNase-Free水配制的1×PBS或生理盐水清洗组织表面的血迹和污渍，使用无尘纸巾吸干表面的液体

④   处理好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的RNase-Free的带螺纹口的耐-192℃超低温冻存管中，迅速置于液氮速冻1小时后转存于-80℃长期保存，在RNA提取前避免反复冻融。

注意事项：

a. 如果实验室没有条件，如缺乏液氮、干冰以及-80℃冰箱等条件下，需要RNAlater及类似组织保存液保存的样本，严格按照操作说明进行，迅速的将样本分割成长宽高≤0.5cm，约豌豆大小的小块（一般重约100mg，不过无需精准测量，一般需要10个小块左右），由于组织块过大会影响RNAlater渗透入组织内部的效率，组织块过大也会造成RNAlater无法完全覆盖组织，而未被RNAlater覆盖的组织部位极易被核酸酶降解。然后投入提前准备好的装满RNAlater的1.5mL的EP管中，使样本完全浸没在液体中，然后置于4℃中保存过夜，干冰运输，或-80℃保存。

b. 不允许寄送用裂解液保存的组织样本，因为实验中发现用Trizol保存的组织样本，无论是研磨好的粉末还是切割好的组织块，所抽提的RNA质量普遍很差；

c. 动物及临床组织不要使用锡箔纸包裹，锡箔纸容易与动物及临床组织粘一起，RNA抽提的过程锡箔纸容易带入，引起污染。

2.2 细胞样品的采集

贴壁细胞的处理：

① 从培养箱取出贴壁生长细胞，显微镜下观察细胞确定生长状态良好弃培养基

② 小心加入与培养基等体积的无酶水配制的1×PBS后，平放1min洗涤细胞，然后弃去PBS，重复一次

③ 加入适量裂解液反复吹打至充分裂解（以TriZol为例，10-15cm的大皿，每次先添加1-2mL，吹打混匀，裂解充分的标准为吹打时液体不粘稠，流动性好。如果液体过于粘稠说明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100μL左右持续添加，直到液体不粘稠为止）

④转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃冰箱长期保存，干冰运输

悬浮细胞的处理：

①选取生长状态良好的细胞悬液

②200-1000g离心5-10min，得到细胞沉淀弃培养基

③加入适量 RNase-Free水配制的1×PBS后，宽口枪头轻柔吹打重悬细胞沉淀，然后用200g离心5min，弃PBS， 重复一次

④加入适量TriZol裂解液反复吹打至充分裂解（裂解标准同上面的贴壁细胞处理方式类似）

④转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃长期保存，干冰运输

注意事项：

a. 勿将干冻的细胞直接寄送，因为细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会容易对RNA和RNA降解

b. 细胞样品勿用胰酶消化，胰酶会消化细胞膜上的膜蛋白，导致细胞破裂，破裂的细胞会释放核酸酶。

2.3 植物组织组织采集

①选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，植物组织越幼嫩越新鲜所含的次生代谢产物越少，随着植物的逐渐成熟，所含的次生代谢产物产量越来越多，而次生代谢产物会影响RNA的抽提。以草莓的花为例，这么个体量的花，4朵即可，其它花朵样本一次类推。

②（部分样本可选做）迅速用预冷的RNase-Free水配制的1×PBS或生理盐水清洗组织表面的污渍，吸干表面的液体。用剪刀剪切成合适的大小（若非特殊情况，长度最好不要超过2cm）

③处理好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的RNase-Free的耐-192℃低温的螺纹冻存管中，或用标记好名称的锡箔纸包裹好，液氮速冻>1小时，转移到-80℃长期保存,在RNA提取前避免反复冻融，干冰寄送样本。若在离体后10min未用液氮速冻降温，极有可能引起样本降解。不可直接将样本放入-80℃保存，此时低活性的RNase仍能引起样本降解

注意事项：

a. 植物组织不建议RNAlater保存，因为植物组织含有细胞壁及次生壁，RNAlater不易渗透入组织内部；特别是表面有蜡质的植物种植，勿用TriZol直接浸泡植物组织

b. 不允许将植物组织磨成粉寄送。

c. 表面含有较多蜡质的植物样本或次生代谢产物含量极高的植物组织或植物组织的茎和根及种子RNA得率通常会较低，为提高RNA的得率需要加大送样量，为普通样本送样量的3-4倍。

2.4 全血/PBMC/血清/血浆以及其他体液样本搜集

联川生物推荐使用BD公司的PAXgene™采血管采集全血，使用BD公司的真空采血管采集全血后分离血清，或使用EDTA紫色抗凝管搜集全血样本以及分离后续的血浆样本。不允许使用绿色的肝素采血管采集全血，因为肝素会影响PCR酶的逆转录效率。

a. PAXgene采血管采集全血方式：

①采血前，应将采血管恢复室温，推荐温度为18-25℃（一般PAXgene采血管保存于室温或4℃，最高不超过40℃）

②采血时，假如前面已经使用了多种采血管采集血液时，应该在最后使用PAXgene采血管；仅用PAXgene采血管时，先用另一个采血管采集1-2mL血样，丢弃该采血管，再使用PAXgene采血管。这种作用是因为，采血器容积能被预灌注，另减少血压造成的冲击力，一定程度上清洗采血管，采血量：2.5ml，适用对象：人和灵长类动物。

③采血后，立即上下颠倒混匀十次左右，18-25℃正立放置2h。④       若不立即提取，将采血管正立置于塑料试管架上（注意：试管架与采血管之间需留有空隙，防止低温保存过程中管壁开裂），先于-20℃放置24h,然后转移至-80℃进行长期保存或转移至干冰中进行运输。注意，在这一步中需要把采血管中的全血样本转到螺纹口冻存管即可放入-80℃冰箱，无需再将冻存管在液氮速冻1小时。

⑤运输时请使用厚壁泡沫盒，放入充足的干冰，在样品保存及运输过程中应避免反复冻融。

b. EDTA采血管/真空采血管采集全血方式：

①样本采集前，先用75%的酒精棉由内向四周对采血部位进行消毒

②采血至特定的采血管中，数量达到负压允许的最大值

③样本采集完成后，立即轻柔颠倒混匀10次。动作尽可能平缓。加入三倍以上体积的TriZol（TriZol:血液≥3:1）裂解液混匀，此时出现沉淀为正常情况。

④混匀完毕后，立刻转入耐-192℃低温的螺纹口冻存管，转入-80℃冰箱保存，干冰运输。注意采血至提取RNA最长时间不得超过一周。

c. 血浆中PBMC提取法：

①接着上一步EDTA抗凝管离心后分层那一步，将Ficoll和PBS从低温恢复到室温

②向50mL离心管（标记A）中加入10mL Ficoll，随后最好静置一段时间；向另一只50mL离心管（标记B）加入10mL PBS

③稀释：温和摇匀抗凝采血管，用 kimwipes或者消毒纱布移除上盖并放一边，将 10mL血液转移至B离心管，温和混合，获得PBS混合液（20mL）

④适度倾斜离心管A，将20mL PBS 混合液沿壁缓慢加入（注意要缓慢，过快会穿破Ficoll层，极大影响提取效果）

⑤梯度离心：小心地将离心管放入离心机（不要扰动液体层），室温400g 20min离心，加速/减速分别设置为1/0

⑥离心之后小心将其取出，放置于操作台上，可见分为四层，见上图

⑦可选：先移除淋巴细胞层上2-3mm的血浆，方便后面吸取

⑧用P1000移液枪尽可能吸取PBMC，转移至15mL离心管，尽量避免吸取血浆和Ficoll

⑨加入PBS 使体积变为10mL，盖上盖并温和翻转摇匀5次

⑩室温 300g 10min离心，加速/减速分别设置为9/9。去上清并轻弹离心管末端，直至细胞团在剩余PBS中完全重悬

注意事项：重复步骤⑨-⑩，最后按照TriZol和体积约3:1的比例加入TriZol保证充分裂解，裂解标准请参考上面贴壁细胞裂解液处理方式

d. 血清样本（外泌体适用）

①建议使用进口医用血清管或真空采血管等收集全血

②上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置

③1800g 10min离心分离得到上层血清样本（全血需在1h内进行血清分离，依据血清管操作说明或客户实验室血清分离步骤进行操作）

④将血清转移至1.5mL离心管中，13000g离心2min；

⑤将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，每份样本至少≥100μL（0.1mL）。液氮速冻1h后-80℃保存，干冰运输

e. 血浆样本（外泌体适用）

①建议使用紫色EDTA抗凝管收集全血样本

②上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置

③1200g 10min离心分离得到上层血浆样本（全血需在1h内进行血浆分离，依据抗凝管操作说明或客户实验室血浆分离步骤进行操作）

④将血浆转移至1.5mL离心管中，13000 g离心2min

⑤将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，每份样本至少≥100μL（0.1mL）。液氮速冻1h后-80℃保存，干冰运输

注意事项：

a.分离血清血浆应严格按照操作说明进行，操作需在1h内完成，避免出现溶血现象，血清血浆分离后避免反复冻融。

b.血清血浆送样量的原则：越多越好，如果客户手头上的血清血浆量较少，则有多少就送多少，通常该种类型的样本RNA含量较低，所以需要通过加大样本量以富集足够多的RNA，以保证后续实验的顺利进行，此外血清血浆RNA通常不质检

c.分离血清/血浆样本的全血不可冷冻，混入的血细胞的样本尽量弃尽，已无法使用

d血清/血浆的RNA得率为2-8ng/mL

小贴士——

溶血现象解释：即因红细胞细胞膜的破裂而导致的红细胞破碎、血红蛋白溢出的现象。溶血可由多种物理或化学因素引起，尤其在人体外，渗透压的变化、机械外力，温度的变化，酸碱度的变化或血液处理的过程中人为添加的一些化学物质，均有可能引起不同程度的溶血

溶血应对策略：(1)血液离开人体后，血液环境的稳定性与保存时间的长短呈反比，细胞膜的稳定性也在下降，在这种情况下，应尽快开展血清血浆的分离；(2)不同的抗凝剂有其不同的分子构型，会对血液中各细胞的细胞膜产生不同的作用，有的会增加细胞膜的稳定性，有的会降低细胞膜的稳定性，所以选择一款合适的抗凝剂至关重要（抗凝剂推荐：EDTA、柠檬酸钠）；(3)血液存放过程中温度过高或反复冻融对细胞膜有很大的损害。温度过高及反复冻融会使细胞膜上的结构蛋白构象发生改变，进而造成细胞膜的弹性降低以致破解产生溶血现象，所以用于分离血清血浆的血液应避免反复冻融

f. 细胞上清液、尿液、唾液、羊水、脑脊液（外泌体相似）

①收集细胞上清液、新鲜尿液、唾液、羊水、脑脊液（起始量按照前面表格中提示），要确保不能溶血（血液中蛋白会污染样品蛋白）；置于4°C 或冰盒中正立放置，转移至RNase-free离心管。以下操作请在样本收集后的1h内进行，以防RNA降解

②在4°C条件下离心3000g约10 min，去除细胞及碎片

③将上清小心倾倒入新的RNase-free离心管（注意不要转移沉淀），在4°C条件下离心13000g约2 min，去除残留的碎片及细胞

④转移上清至全新的耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，液氮速冻1h（可选），严密封口。-80°C保存，干冰运输

注意事项：细胞上清液碎片过多，需要充分低速离心多次去除碎片。收集尿液的前一天饮食要清淡，晨起中段尿（临床），晨间1h的尿液（动物）。唾液搜集之前需要禁食禁烟禁酒2h以上，上午9:30-11:30取样，蒸馏水漱口，将唾液吐于无菌的痰杯（保持水浴），不要咳痰，采集唾液时间为30min左右，4℃ 10000rpm 10min，取上清，经0.22μm滤膜过滤除菌。

2.5 石蜡组织

手术/活检组织石蜡块

RNA单次提取需35mg以上的量。从医院病理科切取手术组织总量≥35mg（绿豆大小，不可取暴露于空气中的组织截面部分），活检组织长度>1cm，需2-3条，蜡块完整，无磕碰损伤的石蜡包埋组织。未切片的石蜡块4℃或常温运输即可

手术/活检组织石蜡卷片/活检组织石蜡切片

RNA提取一次提取<80μm。从医院病理科切取组织厚度约为10-20μm的石蜡卷片，手术组织10张（组织>1×1cm2），或20张（组织<1×1cm2），穿刺组织20-25张。将切好的卷片放置于耐-192℃超低温螺纹口冻存管，迅速浸入液氮速冻>1h, -80℃保存或者干冰运输。

注意事项：

a. 送样优先顺序：石蜡块＞石蜡卷＞石蜡切片

b. 所有石蜡组织样本需尽量送检一年以内的样本，不得超过18个月，建议提供一张免疫组化或组化染色切片

c. 新制切片常温放置应在1周以内，2-8℃放置应在1个月以内，-20℃贮存应在6个月以内

d. 强烈建议每个贴片盒中只存放一个患者的样本；若需与其他患者样本放在一起，必须做间隔区分，防止样本接触造成污染

e. 强烈不建议使用添加瓦楞纸或自折Z形纸摆放石蜡切片，因运输过程中的碰撞会导致石蜡切片挤到一起，造成切片破损或样本污染。

石蜡组织容器

石蜡切片示例

2.6 非致病性细菌样本采集

一次反应所需细菌的量≤1×107个

①显微镜下观察生长状态，收集对数生长期细菌；

②将适量体积的菌液转移至2mL旋盖尖底RNase-Free离心管中，室温或4℃下14000g离心4-10min

③弃尽培养基，将细菌沉淀迅速置于液氮速冻>1h，然后转移至-80℃或液氮中长期保存，干冰运输

2.7 非致病性真菌样本采集

一次反应所需真菌的量≤50mg，将真菌称重，分装多管；将称重后的真菌置于预冷的耐-192℃超低温螺纹冻存管中，迅速投入液氮，速冻时间>1h，转入-80°C长期保存或用干冰直接寄出。

2.8 致病性真菌细菌处理方法

所有可能致病的真菌、细菌RNA项目样品，均需要按下面步骤预处理以后才能寄送至公司，且需要提前通知实验室，明确菌种。溶液A，B可以向实验室索要。实验室将对未经处理的可能致病的样品，进行销毁处理

①细菌/真菌沉淀（不超过30mg，约绿豆大小）加入400ul溶液A，吹打重悬菌体。

②在重悬的菌体中加入400ul溶液B，剧烈震荡混匀。

③65℃水浴或金属浴加热30min，每隔5min剧烈震荡一次，防止分层。

④处理结束以后，-80℃冻存，干冰运输。如为致病菌，请用70%乙醇处理容器表面（注意如处理过程中编号模糊，处理后重新写好编号），确保安全。

注意事项：

（1）室温较低时溶液A可能析出沉淀，可65℃预热2-3min待沉淀溶解后混匀使用。

（2）  溶液B有腐蚀性，使用注意安全操作。溶液B为有机溶液，上层液体为水封，吸取时确保将枪头插入下层液体。

（3）  溶液A，B不互溶，操作时需要震荡充分，使两种液体形成乳浊液。

（4）  样品提交单上请注明：样品经过溶液A，溶液B预处理。

2.9 Total RNA样品

Total RNA一般长期保存于-80℃冰箱，若要寄送可直接使用干冰寄出，或加入适量保存液，再用干冰运输。

RNA的保存介质（建议浓度>50ng/μL）：

①RNA保存液（1/10体积3M NaAc，pH=5.2，3倍体积无水乙醇）

②3倍体积无水乙醇

③RNase-free水（送样量>15μL）

注意事项：

(1)  total RNA中应尽量避免多糖、蛋白、DNA等杂质的残留，送样时需注明溶剂成分

(2)  total RNA应避免反复冻融，由于反复冻融所产生的剪切力会对RNA样品有破坏作用，所以在实际操作中，应对RNA样品小量分装

辅助材料

1. 样本包装注意事项

①在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且不要与乙醇等有机溶剂接触

②不要用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中

③不要用玻璃容器在液氮中保存样本；

④不要把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，因为纸张在液氮中是易碎的

⑤标签纸应该贴于样本袋绳上，不要贴于容器表面以免脱落造成样本混乱

⑥ 不要在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷

⑦ 客户在填写《样本登记单》时应当详细描述（临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段）样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员确定合理的实验方案

3样本储存注意事项

① 液氮速冻完毕后，携带样本的冻存管或锡箔纸等应该立即放入-80℃保存。常规样本在10min内必须立刻使用液氮速冻，不可直接将样本在未经液氮速冻处理后直接放入-80℃保存。未经液氮淬灭的样本中还会残留低活性的酶，从而引起核酸降解以及蛋白变性

② 组织样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，冻存管推荐使用进口的并且耐低温-192℃的螺纹口冻存管，拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。如果因为没有拧紧会导致液氮流入冻存管，空气热胀冷缩后发生爆炸

③ 组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本，务必注意，不要用非螺口离心管和国产冻存管，因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。建议使用第②条提到的冻存管。实在条件缺乏必须使用封口膜将离心管充分封锁防止爆炸（不推荐这样操作）

4样本运输注意事项

① 飞机运输干冰上限约为2公斤，超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。

② 干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输

③ 干冰运输可委托当地快递公司，尽量确保48小时内送达公司，不能送货上门的应提前通知公司相应人员。

④ 24小时到达的，干冰总量不得低于5公斤；48小时到达的，干冰总量不得低于8公斤。夏季可以适当再多增加部分干冰（平时的1.5倍）。不要使用大块状干冰或完全呈粉末状的干冰，而是需要小的圆柱体干冰，否则运输过程中自重比较大的块状干冰可能会在箱内挤压样品盒，移动中可能造成样品盒破裂。如果只有大块状干冰可以使用，那么装箱时先砸碎成小块

⑤ 包装时建议用大塑料袋包裹干冰并在箱中放冰袋，可有效减缓干冰挥发速度。选择合适大小，且箱壁较厚的泡沫箱，并在泡沫箱外纵横方向都缠上透明胶，最好是将泡沫箱外壁用胶带覆盖一遍，带防止运输途中因挤压和抛掷而破裂。泡沫箱全部缠上胶带后，为防止密封过紧，气密性过强，干冰挥发产生过大压力而造成泡沫箱爆裂，用美工刀或其他薄刃刀具，将缠在泡沫盒盖和箱体接合处的胶带刺破一个1-2厘米的小缝隙，以在气压过高时排出气体

⑥ 如委托快递运输，运输过程中应随时跟踪货物的情况，记录货单号，并保持与发出地和接收地的快递公司的联系

5注意事项

① 客户如果提供冻存可复苏的细胞株，应首先验证所用冻存方法用于RNA提取的可靠性，并且在送样时提供详尽的复苏方法，以便确保实验成功

② 所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。

③ 提取RNA质与量：a. 处于不同发育阶段以及不同生长条件的样本中所含有的RNA、RNA以及蛋白的量是不同的，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中核酸的量可能与常规相应样本有显著的差异；b. 储存条件以及储存时间也是影响RNA质与量的关键因素。一般来说从新鲜的样本中总是能够得到预期的核酸量，并且含量相对较高，更容易检测。但是没有保存在液氮或-80℃冰箱中的样本是不可靠的，因此，强烈建议尽可能低温保存。

④ 关于备份，为确保实验的顺利，我们强烈建议您在取样时，应同时备份2-3份，如备份3份，则送给我们两份，如果备份 2份，则送样一份，您自己留一份，以防备部分样本降解，重新取材或送样耽误您的时间。即使样本全部合格，备份的样本您还可以用来进行其他方面的实验（如定量验证，蛋白方面，生化方面的实验等）。备份又分为两种，一种为严格备份，即样本取下后一分为二，这样的两份样本基本上具备同性质。另一种为非严格备份，即生物学重复的样本，这样的备份样本同质性要较前者差。

6样本寄送指南

① 将收集好的样本置于相应的收集管中，为防止样本混淆管盖和管壁均要书写编号，并用封口膜封口；

② 将样本放入自封袋中，在样本提交单上填好样本详细信息（编号等信息必须严格与样本管上一致），将填好的样本单和样本一起放入泡沫箱中；

③ 选用大小合适、箱壁大于4 cm且密封性良好的泡沫箱，并在泡沫箱外纵横方向都缠上透明胶，防止泡沫箱在运输过程中的开裂。

④ 样本寄送步骤：

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